MFGE8抑制微血栓形成在SAH后迟发性脑缺血中的作用及机制

Microthrombus plays a critical role in the delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage(SAH), which may be the reason of failure in treatment towards cerebrovascular spasm. There are multi-factors after SAH induced microthrombus, including vascular endothelial injury and coagulation fibrinolytic system imbalance and cerebrovascular spasm. However, due to the lack of comprehensive therapy to these pathophysiological mechanisms, microthrombus is still a huge challenge for neurosurgeons. We previously found that microthrombus was significantly decreased in the SAH model treated with recombinant human MFGE8. We also demonstrated that chemokine CXCL12 (C-X-C motif ligand 12) could be secreted by injured endothelial cells, which is upregulated by Milk Fat Globule-EGF Factor-8(MFGE8). Based on recent advances in MFGE8 and our preliminary data, we propose that MFGE8 can inhibit thrombosis after SAH, by repairing vascular endothelial injury, maintaining coagulation fibrinolytic balance, and alleviating cerebrovascular spasm. In the present study, We intend to study:①Whether there is amount of microthrombus exist after SAH in MFGE8-/- models, and whose microcirculation still shut down when alleviating cerebrovascular spasm; ②MFGE8 could inhibits thrombosis after SAH with underlying mechanism, including repairing the injury of endothelial cells by activating integrinβ3/5/PI3K/CXCL12 pathway in endothelial cells, inhibiting coagulation function and alleviating cerebrovascular spasm by promoting elimination activated RBC, platelet and other microvesicles. We hope these results would illuminate the role of microthrombus in delayed cerebral ischemia after SAH and the underlying mechanisms of MFGE8 inhibiting thrombosis，which will laid the ground role for the evolving therapeutic strategy after SAH.

SAH后的微血栓在迟发性脑缺血中扮演至关重要的角色,也很可能是缓解脑血管痉挛治疗失败的原因；它的形成涉及血管内皮损伤、凝血-纤溶系统失衡和脑血管痉挛等多种因素，临床中尚难安全有效抑制微血栓的形成。MFGE8蛋白具有独特的结构，在前期实验发现：重组MFGE8治疗的SAH模型中，脑微血栓含量明显下降；脑血管内皮细胞可分泌趋化因子CXCL12，且重组MFGE8可上调CXCL12表达。本课题将进一步验证：①MFGE8-/-的SAH模型存在大量微血栓，导致缓解脑血管痉挛治疗无效；②MFGE8针对多因素抑制微血栓形成：包括激活血管内皮细胞的整合素β3/5/PI3K /CXCL12通路，促进损伤血管内皮修复；促进清除激活的红细胞、血小板及微泡，产生抗凝作用和缓解脑血管痉挛。研究结果将有望阐明微血栓在SAH后迟发性脑缺血损伤中的作用和MFGE8抑制微血栓形成的机制，为临床探索SAH救治新方法提供实验依据。

研究背景：蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后，内皮细胞损伤、蛛网膜下腔的血液成分、局部炎症反应和血管痉挛为微血栓形成提供了有利条件。SAH后，微血栓形成对预后有不利影响。 乳脂球表皮生长因子8（Milk fat globule-epidermal growth factor 8，MFGE8）促进吞噬细胞的吞噬作用，并可能减少微血栓形成。这个项目研究了重组人MFGE8（rhMFGE8）对SAH后血管内皮的修复、微血栓形成和神经功能的影响。 主要研究内容: 采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型。 rhMFGE8和MFGE8 siRNA通过脑室内注射给药。免疫荧光用于标记新生的血管内皮细胞和凋亡的血管内皮细胞。使用western blot使用来检测SAH后内源性MFGE8的表达。使用免疫组化和免疫荧光，通过微血栓计数对微血栓形成进行定量。 在MFGE8 siRNA、SB273005或LY294002干预后，采用western blot来确定与内皮细胞迁移相关的蛋白质表达。通过改良加西亚评分、平衡木实验、Rotarod实验和水迷宫评估了rhMFGE8的神经保护作用。重要结果和关键数据: SAH后，MFGE8的表达在24小时明显增加，并在48小时达到最高值。大鼠脑组织中出现了凋亡的血管内皮细胞，在出血后的第1天最为丰富。脑样本中的微血栓形成最早出现在SAH后3小时，然后逐渐增加，并在SAH后48小时达到峰值，而rhMFGE8显着降低了微血栓形成，并改善了SAH后的短期和长期神经功能。 rhMFGE8干预后，新生的血管内皮细胞增加，凋亡的血管内皮细胞减少，磷脂酰肌醇-3-羟激酶和趋化因子配体的表达增加。 而MFGE8 siRNA减少了磷脂酰肌醇-3-羟激酶和趋化因子配体的表达。经SB273005或LY294002干预后，趋化因子配体的表达降低，且rhMFGE8所诱导的内皮细胞的增殖也被抑制。SB273005还可以降低磷脂酰肌醇-3-羟激酶的表达。科学意义：rhMFGE8促进SAH后凋亡血管内皮细胞的清除, 通过整合素及其下游通路促进血管内皮的修复，从而减少微血栓形成，并最终改善SAH后的短期和长期的神经功能。rhMFGE8可能是促进SAH后神经功能恢复的一个切入点。