基于荧光共振能量转移探针示踪微生物降解偶氮染料

The traditional microbial degradation research relyed on genetic engineering and protein separated and purified technology which can not track the mode of action and the transfer process of degradation of pollutants. Because of lacking strong evidence about the mechanism,most of pollutants microbial degradation process remains on conjectural stage,and which is definitely hindering the mechanism development of microbial degradation. Based on the many azo dyes microbial degradation works of our project team, we will design some fluorescent sensors based on the FRET mechanism to track the azo dye degradation. Azo dyes are non-fluorescent and quenching dyes. When the fluorescent dye is connected with the azo dye by alkyl chain, the fluorescence of the molecule will be quenched. However, the fluorescence will recover when the azo dye is degraded by microorganism. We will study the binding efficiency of the azo dyes with the bacterial cells by selecting of different azo dyes, because different types of azo dyes will show degradation process qualitatively different in or outside bacterial cells. We can manipulate the subcellular location of fluorescent dyes by designing them according to QSAR (quantitative structure-activity relationship) model. Finally, we would like to find out what the key factor and rules are to influence the degradation process and how to improve the efficiency of azo dye degradation methods.This project could establish a new model of microbial degradation and transformation based on chemical fluorescent labeling technology for the research of microbial degradation mechanism.It could provide scientific theoretical guidance for designing and developing novel biodegradable chemical substances.

传统的微生物降解研究所依托的基因工程和蛋白分离纯化技术无法跟踪监测细菌细胞降解污染物的作用方式和转移过程，使大部分污染物的微生物降解过程由于缺乏有力证据而停留在推测阶段，严重阻碍微生物降解污染物的机理研究进展。本项目拟在团队前期大量的偶氮染料微生物降解研究工作基础上，通过设计基于FRET（荧光共振能量转移）技术的荧光探针示踪偶氮染料降解，将荧光染料与偶氮染料相连接，利用偶氮染料对荧光的淬灭作用和降解后荧光恢复的特性，可视化地跟踪监测微生物细胞降解偶氮染料的动力学过程。通过采用不同结构性质（调控染料在亚细胞结构的定位）的偶氮染料，分析偶氮染料与细菌细胞结合效率及其降解方式，总结出偶氮染料的结构性质与细胞结合及降解方式的规律。本项目的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物降解转化研究模式，为微生物降解机理研究开辟新的途径，为生物可降解新型化合物的设计和开发提供科学理论指导。

微生物对有机物污染降解机理的研究，传统的方法都是通过基因工程，蛋白分离和纯化技术，但这些方法都缺少直观可视性。由于传统方法的不足，造成目前微生物对有机污染物降解机理的研究多数停留在推测阶段。因此，快速、灵敏度高、可视化的新方法或新技术的开发显得尤为重要。申请人所在研究团队以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为研究客体，首次将荧光探针技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内的降解过程，阐明微生物细胞对偶氮染料的降解转移特点。.本项目设计并合成了一类对偶氮染料的降解作用有专一选择性的荧光探针NA-MR和NA-OG。 探针在偶氮染料未被降解时，由于分子内存在着分子内荧光共振能量转移（FRET），整体是无荧光的；当偶氮染料部分被细菌细胞的酶降解后，偶氮染料结构被破坏，荧光部分将会发射荧光。所设计合成的两个探针，具有不一样的性质，带磺酸基的探针（探针NA-OG）极性大，不带磺酸基的探针（探针NA-MR）极性小，通过两种探针在细胞实验中的表现，揭示了微生物降解不同极性（水溶性）偶氮染料的不同特点。申请人以偶氮染料为目标化合物，以团队发现的脱色希瓦氏菌S12为研究菌株，首次将荧光探针技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程。本研究表明，在细胞中低极性的偶氮染料能够穿透细胞膜，在细胞内部接受电子降解，但是高极性的偶氮染料由于其不能穿透细胞膜进入细胞内部，只能在细胞外降解。该研究的开展将为直观地展示微生物降解转化污染物的动力学过程提供可视方法，为建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物降解转化研究模式提供基础。