RP2突变导致其蛋白水平降低并引起视网膜色素变性的机制研究

Retinitis pigmentosa (RP) is a kind of inherited retinopathy featured by progressive photoreceptor degeneration and vision loss. Mutations in RP2 gene can cause a severe form of RP. In our preliminary studies, we generated a novel RP2 mutant zebrafish line carrying a 12-bp in-frame deletion by TALEN technology, and for the first time found that the mutation causes complete degradation of RP2 protein, and leads to retinal degeneration in zebrafish. Furthermore, this mutation (P95_G98del) and the pathogenic C86Y and P95L mutation also dramatically decrease the protein level of RP2, suggesting that these amino acid resides might be essential for maintaining the stabilization of RP2. To further explore the molecular mechanism of how these mutations cause RP2 protein degradation, in this project, we intend to identify the crucial region(s) of RP2 protein which are required for its stabilization, to determine which pathogenic mutations of RP2 affect its protein stability, and to further reveal the biochemical pathways involved in the regulation of RP2 protein level by studying the post-translational modifications and the protein degradation pathways of RP2. Our work will fill the gap in the regulatory mechanism of RP2 protein stability, and provide new insights for understanding the pathogenesis of RP caused by RP2 mutations.

视网膜色素变性是一种以进行性感光细胞退化和视力丧失为主要特征的遗传性视网膜病变。RP2基因突变可导致严重的视网膜色素变性。在前期工作中，我们应用TALEN技术获得了一个新的RP2 12bp非移码缺失突变斑马鱼品系，首次发现该突变导致RP2蛋白完全降解并引起视网膜变性表型。进一步地，该突变（P95_G98del）和RP致病突变C86Y、P95L在ARPE-19细胞中均显著降低RP2蛋白水平，提示该区域对于维持RP2的蛋白稳定是必需的。为了深入研究这些突变导致RP2蛋白降解的分子机制，本项目将首先定位RP2蛋白中与其稳定性有关的区域，确定不同致病突变对RP2蛋白水平的影响；并从RP2蛋白的翻译后修饰和降解方式入手，揭示细胞内调控RP2蛋白水平的生化途径。本项目如获资助并成功实施，将填补RP2蛋白稳定性调控方面的空白，为阐释RP2突变导致视网膜色素变性的机制提供新的认识。

视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa, RP)是一组以夜盲、视力下降、视野收缩、眼底色素沉积等为主要临床特征的进行性视网膜变性疾病。RP2是X连锁RP中第二常见的致病基因，目前已有70多个突变被报道。.在前期工作中，我们应用TALEN技术获得了一个新的rp2 12bp缺失突变（c.357_368del, p.P120_G123del）斑马鱼品系。本项目中，我们发现该突变不影响rp2的mRNA水平，但导致Rp2蛋白几乎完全降解，并引起视网膜变性表型。鉴于RP2蛋白在人和斑马鱼之间高度的保守性，我们推测在RP2病人中发现的致病突变可能也具有类似的效应。后续实验证明，在22种RP2致病突变（错义和单氨基酸缺失）中，12种可显著降低RP2的蛋白水平。通过基于RP2晶体结构的生物信息分析，我们发现这些突变破坏了RP2蛋白的结构稳定性，从而可能导致蛋白质错误折叠和降解。对体外表达和纯化的野生型和突变型RP2蛋白进行DSF（Differential scanning fluorescence）分析也证实了突变型RP2蛋白不能正确折叠或稳定性显著下降。.为进一步探明RP2蛋白各个结构域对其蛋白稳定性的影响，我们构建了一系列N端和C端截短的RP2突变体并对其蛋白水平进行了检测。结果显示，RP2蛋白的N端TBCC结构域极不稳定，而C端NDPK结构域则具有稳定整个RP2蛋白的作用。此外，我们还发现N端的脂酰化修饰也是RP2蛋白在细胞内维持稳定的必要条件。通过抑制不同的蛋白质降解途径，我们发现不稳定的RP2蛋白主要由蛋白酶体途径降解。.对于不影响RP2蛋白稳定性的致病突变，我们通过GST-pulldown实验证明R118H/G/L/C和E138G突变显著减弱了RP2与ARL3的相互作用，而T87I、L188P和R211H/L对RP2蛋白功能的影响还有待进一步研究。.总而言之，本项目利用斑马鱼动物模型、细胞系模型、体外生化研究和生物信息分析等手段，首次系统性地调查了RP2致病突变对其蛋白结构和功能的影响。我们发现大部分RP2突变致病的原因是破坏了RP2蛋白的稳定性并导致蛋白酶体介导的降解。我们的工作建立了对RP2突变进行评估和分类的方法与标准，同时也为开发促进RP2蛋白稳定性和抑制RP2蛋白降解的小分子药物提供了理论基础和研究方向，具有重要的科学意义和临床价值。