地克珠利诱发柔嫩艾美耳球虫GAPDH介导的细胞凋亡机制研究

GAPDH介导的细胞凋亡与人类神经性疾病密切相关，已成为人类疾病学热点研究领域。本课题组在前期工作基础上，发现抗球虫药物地克珠利可诱发柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子此类凋亡，这在原生生物研究领域为首次发现。针对这一崭新科学发现，本项目拟开展以下研究工作：利用球虫鸡体感染动物模型，采用免疫共沉淀、Western blotting等分子生物学技术，研究其凋亡通路及相关蛋白；利用球虫体外细胞培养模型，借助不同Caspase抑制剂，考察已知的Caspase依赖的凋亡途径与此类凋亡途径之间关系；以妥曲珠利为参照，推导诱发该凋亡途径的药物功能团。本项目的完成，不仅可以为深入了解地克珠利抗球虫分子机理，发现新的药靶蛋白，设计新的抗球虫药物，提供重要理论基础和技术储备，而且将大大扩展寄生虫研究领域。

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的一个关键酶，主要催化3-磷酸甘油醛生成l,3-二磷酸甘油酸。一直以来，GAPDH被认为在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量恒定，但近年来，越来越多的研究发现，GAPDH是一个多功能蛋白，而其中最引人注目的则是发现GAPDH介导了多种因素诱发的细胞凋亡。尽管已经证实大部分寄生虫种类存在部分类似后生动物细胞凋亡途径，但是尚未见GAPDH核转位介导的细胞凋亡途径报道。本课题组在前期工作基础上，首次在原生生物研究领域发现，抗球虫药物地克珠利可诱发柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子此类凋亡。借助差异蛋白组学方法，我们发现地克珠利对GAPDH蛋白有较强调控作用。Western blot结果表明，地克珠利作用组，GAPDH蛋白表达量显著上升。利用荧光实时定量PCR技术，我们分析了地克珠利作用球虫后，GAPDH mRNA水平的变化。实验结果表明：相对对照组，地克珠利作用后，GAPDH mRNA表达明显增加。利用免疫组化方法，我们检测了柔嫩艾美耳球虫GAPDH蛋白亚细胞定位，可以观察到：在柔嫩艾美耳球虫入侵过程中，GAPDH蛋白分散表达于球虫胞浆内，细胞核内几乎检测不到GAPDH蛋白的存在；经过地克珠利处理后，GAPDH蛋白集中、大量表达于球虫细胞核之中。脱氢酶活性实验结果表明，尽管地克珠利作用后，GAPDH亚细胞定位发生变化，大量GAPDH转位至核内，然而细胞核内GAPDH脱氢酶活性小于胞浆GAPDH脱氢酶活性，这一结果表明地克珠利诱发的柔嫩艾美耳球虫GAPDH介导的细胞凋亡过程中，GAPDH构型发生了变化，丧失了部分脱氢酶活性。另一方面，借助不同Caspase活性检测试剂盒以及抑制剂，我们发现GAPDH介导的细胞凋亡与Caspase9 相关，与Caspase8 无关。这一系列实验结果，较好地解决了我们项目标书提出的科学问题，更清晰地描述了地克珠利抗球虫机制，也为新型抗球虫药物的研制提供了新的药物靶标。.项目执行三年来，发表SCI文章三篇，影响因子均为2分以上，培养硕士研究生一名，其获得中国农业科学院优秀硕士论文奖励。