基于进化和重测序研究柔嫩艾美耳球虫对地克珠利抗药性的分子机制

Diclazuril is an anticoccidial drug with the lowest concentration when applied to prevent coccidiosis and thus is widely used. Recent investigations showed that diclazuril-resistant coccidia are very common in the field. However, it is unknown of the target gene(s) or the molecular mechanisms directly related to diclazuril resistance. In this study, we will establish an experimental evolution system to select diclazuril-resistant strains of Eimeria tenella based on population size of the parasites and the concentration of the drug. We will get the evolved populations with diclazuril resistance. We will sequence pooled samples (pool-seq) of diclazuril-resistant and sensitive strains from both laboratory-evolved and field-isolated populations and then analyze the allele frequency to find out the selective sweep region. The candidate genes derived from the above analysis will be validated by CRISPR-Cas9 based gene replace, overexpression or mutation to reveal the mechanisms controlling drug-resistance. After accomplishing this project, 5 graduate students will have been trained and 3-5 international peer-reviewed articles will have been published.

地克珠利是目前抗球虫药物中作用浓度最低的一种，广泛用于畜禽球虫病的预防。国内外研究均表明地克珠利抗药性球虫在养鸡场普遍存在，但地克珠利抗球虫作用的靶基因及分子机制仍属未知。我们将建立实验进化体系，在实验条件下对群体大小不同的柔嫩艾美耳球虫施加强度不同的药物压力进行正向选择，获得地克珠利抗药虫株的实验进化群体；同时在田间分离地克珠利抗药虫株的自然进化群体。进一步对这些群体及药物敏感群体进行混池测序，通过群体遗传连锁不平衡原理分析抗药性群体基因组的选择性清除区域，找到靶标候选基因，并基于CRISPR-Cas9介导的基因替换等技术进行基因功能验证，最终解析柔嫩艾美耳球虫对地克珠利产生抗药性的分子机制，为建立抗药性分子检测方法提供技术支持。培养研究生5名，发表国际论文3-5篇。

球虫耐药性是畜牧生产中的难题，也是制约养殖效益的核心因素之一。地克珠利是应用最广泛的抗球虫药物，耐药问题严重。研究小组通过地克珠利田间耐药虫株筛选、实验室进化体系诱导地克珠利耐药虫株，利用基因组重测序技术，采用三种不同的遗传学算法对地克珠利耐药性相关基因位点进行精细定位，获得耐药基因候选突变位点。在此基础上，通过基因过表达的方式将受筛选的候选区域的12个基因进行过表达，获得混池基因过表达虫株。通过药筛和荧光标记，经流式筛选扩增对后代进行不同程度耐药性测试，验证候选基因与地克珠利耐药表型的关联度。另一方面，拓展性的建立了实验室条件下模拟田间的快速耐药虫株诱导体系，进行了常山酮、盐霉素等常用抗球虫药物抗药基因的解析，验证和丰富了本项目关于抗药基因产生的遗传机制的科学假说。本项目研究结果为揭示寄生虫抗药性产生的遗传机制提出了基础数据，对抗药性快速监测技术体系的建立及新药研发具有重要参考价值。.在该项目的资助下，已发表研究相关的研究论文10篇，其中SCI文章6篇。授权国内发明专利2项，申请1项。培养毕业博士研究生3名，毕业硕士研究生1名，在站博士后1名，在读博士研究生1名，在读硕士研究生1名。超额完成任务书中预期研究目标（发表SCI论文3-5篇；培养研究生5名）。