假丝酵母Pif1解旋酶多元化参与端粒末端合成与校对的作用及分子机制研究

Telomerase is one of the important molecular motor proteins in organisms. An increase in telomerase activity is closely related to the occurrence of tumor cells. Therefore, clear regulation of telomerase activity mechanism is of great significance for the diagnosis and treatment of tumorigenesis. Candida Pif1 is a multifunctional helicase. Recent studies have found that Pif1 helicase can knockdown telomerase from the DNA terminal. Moreover, this activity of Pif1 helicase in regulating telomerase function has also gained considerable attention in recent years. We recently found that Candida Pif1 exhibits exonuclease activity; therefore, we purified to obtain high-purity functional Candida telomerase, which laid the theoretical foundation for our follow-up research. The proofreading mechanism by which Candida Pif1 participates in the process of telomerase polymerization has not yet been reported. The specificity and conservation of telomere repeat sequences play a very important role for recognition of telomeres by telomerase. When telomeres are not identified by telomerase, the telomeres fuse with the neighboring chromosome(s), leading to the instability of the genome, which in turn causes major human diseases such as premature aging and malignant tumors. In this study, we aimed to determine the mechanism by which the two activities, viz, helicase and exonuclease, of Candida Pif1 are involved in the molecular mechanism of telomere end-synthesis and proofreading, the three-dimensional structure of Candida telomerase, and interpreting the function of telomerase from the structural point of view.

端粒酶是生物体内非常重要的分子马达蛋白，端粒酶活性的增加与肿瘤细胞的发生密切相关，因此明晰调控端粒酶活力的机制，对于肿瘤发生的诊断及其治疗具有不可忽视的意义。Pif1是一种多功能的解旋酶，新近研究发现，Pif1解旋酶可以从DNA末端撞击掉端粒酶，这种对端粒调控机制的研究也成为了近几年的研究热点。我们近来发现假丝酵母Pif1具有核酸外切酶活力，为我们后续研究假丝酵母Pif1可能参与端粒末端的校对提供了理论基础。假丝酵母Pif1参与端粒聚合过程中的校对机制一直未见报道，端粒重复序列的特异性和保守性对端粒酶识别端粒起着非常重要的作用，一旦端粒未被端粒酶识别，势必导致基因组的不稳定，最终使细胞内稳定性改变而导致早衰及恶性肿瘤等人类重大疾病的发生。本项目拟研究假丝酵母Pif1的解旋和外切两种功能是否多元化的参与端粒末端合成与校对及分子作用机制并得到假丝酵母端粒酶的三维结构，从结构角度解读功能。

端粒酶的活性与肿瘤的发生密切相关，而端粒末端的复制延伸机制较为复杂。酵母端粒酶包含逆转录活性的核心酶CaTERT（Est2p），同时还有多个亚基共同参与端粒末端的合成与校对，并且一些其他辅酶也在其中发挥重要作用。本项目选择了端粒结构比较典型的热带假丝酵母作为研究对象：酵母端粒与哺乳类细胞中端粒的复制机制有明显的区别，酵母端粒RNA长度超过1500nt，而人和其他哺乳动物的端粒RNA只有400nt左右；酵母端粒末端的重复序列有20-23nt之多，而人的重复序列只有6nt，直接导致两类生物的端粒末端延伸的分子机制有很大区别。.端粒酶RNA包含几个极其保守的结构域，RNA的正确折叠并暴露出端粒模板区是保证端粒末端合成的重要保障。多轮次的聚合延伸可以增加端粒末端的序列长度，以弥补聚合酶复制的缺陷，但重复序列的长度增加至20-23bp后，每轮次打开链间的双链就可能需要解旋酶的参与。.项目中重点研究了可能参与端粒末端合成的热带假丝酵母Pif1解旋酶（Capif1），并对其重金属的毒理抑制分子机制进行阐述。在项目进行的过程中我们发现了另一个比较有趣的现象并进行深入研究。Est1p是酵母端粒酶中重要亚基之一，参与端粒末端的合成，对染色体的稳定性，细胞的凋亡起到关键的作用。我们体外表达的热带假丝酵母Est1p亚基不仅具有结合核酸的能力，还意外的发现其可以打开双链核酸，并且通过研究发现其在打开双链核酸的过程中依赖于水解ATP的能量，并对三磷酸的种类表现出一定的倾向性。同时Est1p对底物结构也具有一定的选择性，只能打开5’-悬垂尾链结构的dsDNA底物，且对悬垂尾链长度有一定的要求，但无法与链间单链气泡结构底物发生作用，有趣的是Est1p还表现出改变G4结构的能力，这种能力可能在酵母端粒末端的延伸方面具有重要的生理意义。