cltca在斑马鱼肠道发育中的功能与作用机制研究

The intestine is an important organ in the digestive system of vertebrate animals, and many important functions, including absorption, digestion, endocrine and immune defense, relies on the intestinal epithelium. However, the molecular mechanism behind intestinal development in embryos is poorly understood. We have previously constructed a pool of potential zebrafish mutants by using pseudo-typed retroviral insertional mutagenesis strategy. One of the mutations disrupted cltca (clathrin heavy chain a), leading to gut hypoplastic phenotype. The lumen opening and fusion were not affected in homozygous mutant embryos, while the intestinal bulb primordium could not undergo expansion of the luminal space to adopt a rounded appearance. The epithelium of intestine appeared thicker, with cells extended and crowded into the luminal surface. In addition to abnormal intestinal bulb formation, cltca mutant also showed defects in the distribution of Claudin 15la and enterocyte differentiation. In this project, we will explore the detailed function of cltca and the molecular mechanisms behind these events, and further investigate the signaling pathway regulated by Cltca during intestinal epithelium development. The findings of this project will bring new insights in understanding the role of Clathrin in embryonic development and the regulatory network governing intestine development.

肠道是脊椎动物消化系统的一个重要器官，其中肠上皮是肠道执行吸收、消化、内分泌及免疫防御功能的主要场所，阐明肠上皮发育的分子机制至关重要。然而目前对胚胎期肠上皮发育过程仍然缺乏清晰的了解。本实验室前期通过反转录病毒插入诱变筛选到一批斑马鱼突变体，其中cltca 纯合突变胚胎呈现肠道发育缺陷的特异表型。cltca 突变不影响肠腔的出现与融合，但肠球无法正常膨大，肠上皮增厚并向腔内堆积，部分细胞散落在腔内；此外，cltca突变改变了肠上皮细胞中紧密连接蛋白的定位，且严重影响吸收型肠上皮细胞的分化与成熟。本项目拟在此基础上深入研究cltca 的功能与作用机制，包括cltca对紧密连接蛋白Cldn15la在肠上皮的定位以及对吸收型命运发育的调控，并试图建立cltca与影响肠道发育的信号通路及代谢途径间的关系，推动我们理解网格蛋白在胚胎发育中的作用以及肠上皮发育的机制。

Clathrin是一类进化上非常保守的蛋白质，在真核细胞中最重要的功能为调控细胞内的膜泡运输。尽管在细胞生物学层面Clathrin发挥功能的分子基础已较为清楚，但其在脊椎动物肠道发育和疾病发生中的角色仍有待阐明。本项目以斑马鱼为模型，探究了网格蛋白重链a基因（clathrin heavy chain a, cltca）在肠道早期发育及疾病发生中的功能及作用机制。首先综合运用通过多种方法在组织、细胞及分子水平对cltca突变体进行了精细表型分析。在组织与细胞层面，证明cltca功能缺失可特异造成斑马鱼胚胎肠球膨大、肠上皮结构异常、吸收型肠细胞分化成熟受阻、肠上皮增殖减少并发生凋亡等肠上皮发育缺陷及生理功能失调，并出现与人类先天性腹泻与肠病（CODE）类似的病理特征。在分子和亚细胞层面，突变体肠上皮细胞中本应在基底外侧膜定位的密封蛋白Cldn15la和本应定位于顶膜微绒毛中的顶膜蛋白Annep（4E8）在胞内发生异常滞留和聚集；敲低cldn15la的表达可部分拯救cltca突变体的上述肠道发育缺陷的表型，并且顶膜蛋白Annep也在很大程度上恢复了其在顶膜上的正常分布，说明Cldn15la蛋白的异常聚集是引发cltca突变体多种异常表型的一个重要基础因素。进一步研究发现，编码斑马鱼网格蛋白接头蛋白AP-1复合物μ1B亚基的ap1m2基因缺失后可部分模拟cltca突变体的肠道表型，并且同样可导致Cldn15la蛋白的亚细胞定位错误；μ1B亚基可识别Cldn15la蛋白胞质端的YXXØ基序并介导Cldn15la的基底外侧膜分选。因此，Cltca与AP-1B共同介导了肠细胞中Cldn15la的基底外侧膜分选，该过程失调将严重阻遏肠细胞的分化成熟。本项目的研究结果揭示了Cltca-Ap1m2-Cldn15la轴在斑马鱼肠细胞发育中的重要功能，为理解网格蛋白在脊椎动物肠道发育中的特异性作用提供了新的线索，为阐明先天性肠细胞发育不良相关疾病的分子调控机制提供了新的信息，同时也在体内（in vivo）水平揭示了Claudin在基底外侧膜的一种定位调控机制，充实了基底外侧膜相关Claudin的功能与作用机制研究。