杂肽聚酮化合物兰杀菌素生物合成及相关酶功能研究

Lankacidins consist of a class of hybrid trans-AT polyketide-peptide natural products that feature a transannulated heptadecane skeleton. The compounds of these family show strong antimicrobial activities against Gram-positive pathogenes, anti-parasites and in vivo antitumor actitity against certain cancer cell lines. Although the biosynthetic gene cluster of lankacidins have been reported, there are still unsolved question. Our group have identified a lankacidin gene cluster from Amycolatopsis sp. Hca4 genome, by using cosmid-heterologous expression, a serial of lankacidin natural product were identified from broth of heterologous host, specially the decarboxylated derivatives, lankacyclinol. This project will combine in vivo gene inactivation and in vitro enzyme catalysis to investigate the interaction of polyketide synthase, amide oxygenase and missing decarboxylase of lankacidins biosynthesis, finally, to reveal the specific mechanism of biosynthesis of natural product synthesized by trans-AT PKS.

兰杀菌素(Lankacidin)是一类特殊的十七元大环全碳骨架杂肽聚酮化合物，该家族化合物具有良好的抗革兰氏阳性菌、抗寄生虫以及抗癌活性。其基因簇虽已有报道，但整个生物合成过程中仍然存在着许多未解之谜。本项目前期工作从Amycolatopsis sp. Hca4中鉴定出一个兰杀菌素基因簇，通过柯斯质粒异源表达技术，成功产生一系列兰杀菌素化合物并首次异源表达出脱羧lankacyclinol。本项目将通过体内基因失活实验和体外蛋白功能表征，对兰杀菌素生物合成过程中的聚酮合酶相互作用、胺氧化酶和缺失脱羧酶进行功能和机理的研究，最终，阐述trans-AT聚酮合酶基因簇在合成天然产物的独特机制。

兰杀菌素是一类重要聚酮天然产物，其生物合成过程中由杂合的PKS和NRPS酶所催化形成。然而在其合成过程中仅有五个模块就完成了十七元环全碳骨架的构建，是目前最为复杂的Trans-AT聚酮合酶。而催化此步骤的聚酮合酶的功能解析长期处于停滞状态，目前仅有少数研究提供间接证据来证明其催化过程。于是本研究以兰杀菌素为研究对象，通过基因组信息分析和异源表达成功激活稀有放线菌Hca4中一条兰杀菌素类基因簇，并对其产物进行结构解析。构建了体内基因敲除突和各个结构域活性位点失活突变株，发酵确定各个基因功能并从LkcE突变株中分离得到未环化代谢产物，最终指认出兰杀菌素最小生物合成基因簇和潜在环化脱羧酶LkcE，并获得LkcE的蛋白质晶体。后续为确认兰杀菌素聚酮合酶的具体作用顺序，首先通过基因挖掘的策略，挖掘到一株可产生兰杀菌素类天然产物的大肠杆菌近缘的海洋变形菌H. chejuensis。经发酵和代谢产物分离后，明确其同样可以产生兰杀菌素，同样敲除关键环化酶CheE后，也分离得到了未环化线性产物。以大肠杆菌为表达宿主，获得兰杀菌素基因簇中所有可溶蛋白，并利用体外全酶反应系统，以基本小分子重构出兰杀菌素生物合成过程。通过化学合成的方式合成出Trans-AT聚酮合酶CheC的关键底物，首次通过体外酶学过程证明兰杀菌素Trans-AT聚酮合酶的迭代作用机制，并利用化学-酶法相结合的策略获得兰杀菌素结构类似物。最终以此可溶性系统为对象，首次对大型Trans-AT聚酮合酶的全酶结构进行研究，并成功获得分辨率高达2.6埃的冷冻电镜结构。本研究不仅解析了兰杀菌素合成途径，也为后续Trans-AT聚酮天然产物结构改造提供了理论基础。