谷胱甘肽在假丝酵母抵抗酸胁迫中的作用机制

假丝酵母在利用己糖和戊糖发酵生产酸性生物基化学品的过程中，常遭遇酸胁迫环境，增强细胞适应或抵抗酸胁迫的能力将有助于促进目的产物的过量合成。本项目以一株能在胞内合成谷胱甘肽（GSH）的产朊假丝酵母WSH02-08作为模式微生物进行研究，运用基因工程技术分别敲除细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的编码基因gsh1和gsh2，构建GSH生物合成缺陷的突变株gsh1￣ 和gsh2￣。通过恒化培养，从细胞和分子水平研究酸胁迫前后出发菌株和突变株在生长特性、细胞结构、胞内微环境（pHi、氧化还原电位）、物质代谢、能量代谢和关键酶活性等方面的差异，以及酸胁迫引起GSH向胞外分泌的作用机制。研究结果将拓宽对GSH在假丝酵母中生理作用的认识，并有助于深入理解假丝酵母对酸胁迫的响应和调节机制，为发酵法过量合成酸性生物基化学品的过程优化与控制策略提供新的思路。

产朊假丝酵母在利用糖类物质发酵生产各类大宗或精细化学品的过程中，常遭遇酸胁迫环境，增强细胞适应或抵抗酸胁迫的能力有助于促进目的产物的过量合成。本研究以一株能在胞内合成谷胱甘肽（GSH）的产朊假丝酵母作为模式微生物进行研究，运用基因工程手段成功构建了基因敲除组件pGAP:kan，实现了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的编码基因gsh1和gsh2的部分敲除，获得了gsh1和gsh2基因部分敲除的杂合突变株C. utilis Δgsh1和C. utilis Δgsh2。在恒化培养条件下，分别确定了pH 3.5处理6 h和pH 1.5处理2 h为弱酸胁迫和强酸胁迫方式。在此基础上，对出发菌株和突变株进行酸胁迫处理，通过比较GSH合成及胞内外分布、胞内pHi、γ-GCS活性、糖酵解关键酶活性、细胞氧化还原状态、物质和能量代谢等方面的差异，发现GSH对于提高酵母细胞抵抗酸胁迫的能力具有重要作用。在研究中还发现，除了GSH合成酶以外，提高胞内与能量代谢有关的辅因子NADH和ATP的水平也有助于胞内GSH含量的增加。在能量代谢分析的基础上，结合与GSH生物合成密切相关的含硫化合物S-腺苷蛋氨酸（SAM），探讨了合理利用胞内过量的ATP以及外加能量辅助物质柠檬酸钠在提高胞内SAM和GSH含量中的作用及其机制。与此同时，还考察了不同的亚硒酸钠添加方式对胞内GSH含量及GSH在胞内外分布的影响，获得了胞内GSH含量和生物学性能明显提高的产朊假丝酵母。研究结果增加了对GSH在微生物胞内生理功能的认识和理解，有助于提高产朊假丝酵母对酸胁迫的响应和抵抗能力。同时，本研究结果特别是能量代谢分析方法也为其他酸性生物基化学品的发酵过程优化与控制提供了可行的思路和策略。.