npdc1a在斑马鱼卵细胞发育中的功能研究

Cortical reaction is an important process during vertebrate fertilization, which will prevent polyspermy and provide an essential environment for zygote development. Previous studies showed that cytoplasmic Ca2+ wave is necessary for the induction of cortical reaction, while the mechanism is poorly understood. Utilizing TALEN-mediated gene knockout, our lab generated many zebrafish mutant lines. One of the mutants, npdc1a, showed defective chorion elevation in F3 embryos. The mutant females had normal ovary structures, while in their oocytes, cortical granules were not exocytosed during cortical reaction, leading to the chorion elevation defect phenotype. In this project, we will explore the function of npdc1a during cortical granule exocytosis, and illuminate the molecular mechanism of cortical reaction, especially evaluate its potential interaction with Ca2+ signalling and the dynamics of actin filament network. In addition to the cortical reaction defect, npdc1a mutant oocytes also showed defects in yolk body maturation and the distribution of yolk bodies and cortical granules. We will further investigate the regulatory pathway behind yolk body maturation, and investigate the potential relationship between yolk body and cortical granule distribution. The findings of this prject will help us to further understand the mechanism of cortical reaction and zebrafish oogenesis.

皮层反应是脊椎动物卵细胞在受精过程中的重要步骤，主要功能是阻止多精受精和保障受精卵发育。目前已知胞质内钙振荡对皮层反应是必需的，但Ca2+的调控机制却并不清楚。本实验室通过TALEN介导的基因组定点突变技术得到了一批斑马鱼突变系，其中npdc1a纯合突变雌鱼所产胚胎呈现卵膜不能鼓起的表型。npdc1a突变雌鱼卵巢结构正常，但生成的卵细胞皮层反应出现异常，皮质颗粒无法进行胞吐作用，因而导致卵膜无法正常鼓起。本项目拟在此基础上深入研究npdc1a的功能，特别是在皮层反应中与肌动蛋白—微丝动态变化以及与钙离子信号通路潜在的相互作用，为揭示皮层反应的分子机制提供突破口。此外，npdc1a突变雌鱼的卵母细胞中卵黄小体的成熟出现缺陷，卵黄小体与皮质颗粒的相对位置分布也出现了异常。本项目将同时研究npdc1a在卵黄小体成熟过程中的作用，以及卵黄小体与皮质颗粒分布的关系与相互作用，推进我们对皮层反应和斑马

NPDC1 最早被发现在人类神经细胞中参与调控神经细胞的增殖和分化。哺乳动物中NPDC1主要在神经系统、胰腺、乳腺、前列腺、卵巢等分泌性组织中表达，但是其相关功能的研究很少，斑马鱼中尚无任何报道。小鼠Npdc1蛋白主要分布于卵细胞膜和细胞质中，斑马鱼Npdc1a蛋白则主要定位于皮层颗粒。本项目构建了斑马鱼npdc1a 的突变体，发现npdc1a纯合突变的雌鱼所产子代胚胎的卵膜无法举起，且这一表型与子代胚胎的基因型无关。通过酶解结合机械吹吸的方法成功分离不同时期的斑马鱼卵母细胞进行RNA-Seq，发现npdc1a特异地在 IV期卵母细胞中高表达，表明Npdc1a参与调控III期到IV期卵母细胞的发育过程。npdc1a的缺失不影响卵膜的形成，但干扰了皮质颗粒与卵黄小体的相对位置分布，皮层反应受阻，导致卵膜无法举起。外源性的Ca2+可以激活皮层反应，但无法拯救这一表型，表明npdc1a对激活过程的调控不位于Ca2+通路的上游。npdc1a缺失干扰了卵母细胞中微丝网络的形成，这很可能是导致皮质颗粒无法进行胞吐作用的原因。结合前人的研究结果，猜测Npdc1a可能通过与某种Rab蛋白的调控因子相互作用，调控卵母细胞中的皮质颗粒分布与胞吐。. 本项目建立了一套斑马鱼卵母细胞体外培养、显微注射和体外受精的实验技术，可以保证在卵母细胞未激活状态（可保持4小时）下完成显微注射过程。利用这一技术对斑马鱼卵母细胞进行显微注射，可验证Npdc1a与Dennd2da结合的可能性，同时通过注射Rab3aa与Rab6a组成型激活与显性负效的mRNA观察皮质颗粒的定位以及微丝组装状况，验证Npdc1a是否通过调控Rab蛋白相关过程影响微丝组装和皮层反应。此外，Npdc1a对卵黄小体的成熟过程是必需的。对 npdc1a纯合突变雌鱼的卵巢组织进行高通量测序分析结果表明，Npdc1a特异地调控了卵巢中卵黄蛋白原家族基因vtg的表达。. 本项目的研究结果拓展了对Npdc1功能的认识，细致地解析了斑马鱼卵母细胞成熟和激活过程中皮层反应的调控机制，建立的新型卵母细胞操作技术为后续对母源基因进行遗传操作和功能研究奠定了必要的基础，高通量测序结果也为更深入的功能与机制研究提供了重要线索。