基于准种分析的HBV耐药机制研究及虚拟表型分析技术的初步研究

：Drug resistance to nucleoside/nucleotide analogues has been the main problem which constraints long-term antiviral therapy in chronic hepatitis B patients. Clinical drug resistance in some patients but not detect the known resistance Loci. Serial serum samples are collected at baseline、regular followup and virological breakthrough in patients with chronic hepatitis B receiving nucleoside analogue treatment. The charcteristics of HBV quasispecies in entire RT region are determinted by PCR cloning and sequencing method, followed by the bioinformatic analysis. The HBV quasispecies with different outcome (brearthrough versus maintained reaponse or sustained response) are compared,investigating the quasispecies distribution and evolution in patients with drug resistance. Typical quasispecies seclected are connected with 1.3 time genome vector and their phenotyps are analysed in Huh 7 cells, using the population genotyping method on the basis of the above work. The quasispecies phenotypic analysis data, clinical data are collected to build a preliminary database of quasi-resistance analysis, usiing multivariate analysis and bioinformatics tools. Therefore, a preliminary .analysis platform of virtual phenotyping are established, and preliminary validation will be perfomed. Thus this study will help to elucidate the mechanism of resistance from the HBV quasispecies angle, and to provide economic and reliable analysis for .clinical decision.

核苷类似物耐药是制约慢性乙型肝炎长期抗病毒的主要问题。目前尚无基于准种分析的耐药机制研究。本研究收集接受核苷类似物抗病毒过程中发生病毒学突破的慢性乙型肝炎患者基线、各治疗时间点及病毒学突破时的系列血清。应用PCR克隆测序方法研究HBV 逆转录酶区准种特征、不同变异株分布及准种进化特征，比较发生病毒学突破/耐药患者与持续应答患者的基线准种特征，探讨准种分布及进化特征与耐药发生的关系。并从中筛选出典型准种，连接1.3倍复制型载体，在Huh 7细胞系中进行体外表型分析，并运用整体表型分析技术（population genotyping），分析准种整体体外表型。在上述工作的基础上，综合各准种体外表型分析数据、患者临床资料构建基础准种耐药分析数据库，应用多因素分析及生物信息学方法，初步建立虚拟表型分析平台，并初步验证。从HBV准种角度进一步阐明耐药机制，并为临床耐药提供经济可靠的参考依据。

核苷类似物耐药是制约慢性乙型肝炎长期抗病毒的主要问题。本课题开始前目前尚无基于准种分析的耐药机制研究。本课题组成员对符合条件的病例连续入组，并对入选的病例进行临床随访。入选的患者包括本院门诊及就诊病例及济南市入选的参加“山东省乙型病毒性肝炎防治综合示范区规模化现场流行病学和干预研究”项目（编号2009ZX10002-028）之子课题——乙肝病毒感染人群队列建立和干预研究”。该子课题项目负责人为本项目主要成员王磊教授。该课题共入选患者48例，该队列均为服用阿德福韦酯患者，其留取的血清标本及临床资料与本项目共享。患者入组及血清标本收集工作在项目第1年完成。其中包括耐药患者12例，均为阿德福韦酯耐药患者，无耐药患者22例。随访时间均超过12个月。对收集的病例血清，进行PCR扩增，产物纯化，克隆，测序并留取准种样本。建立HBV RT准种文库，按照项目计划于2014年底完成准种文库构建，文库综述超过1500个克隆。准种测序工作顺利完成。同时在构建文库过程中包括了成对母女HBV全长序列准种研究，探讨了同一HBV准种在不同个体进化的方式及其与耐药的关系，利用前期建立的生物信息学分析平台，分别计算准种复杂度、离散度及准种进化速率，并关注主要耐药位点。结果发现应答者治疗早起病毒复杂度下降，而耐药患者复杂度先上升，待发生病毒学突破时准种复杂度上升，提示准种特征与耐药相关。结合临床资料，筛选了2例患者的系列准种变异株行体外表型实验的实验。主要根据上游突变结果，连接1.3倍载体，转化至Huh7细胞，经Southern印迹法验证复制能力。该部分实验反复多次结果均不理想，且重复性不佳。数据无法采用。通过本课题研究初步阐明了准种特征和耐药发生的关系，即准种复杂度升高发生在耐药之前，是促成耐药的重要因素。课题期内因体外表型分析实验重复性不佳暂未能证实该结论，进一步改进实验方法后有望进一步验证这一耐药机制。