针对乳腺癌细胞代谢物的特异性脱氧核酶分子探针研究

Recognition and identification of tumor cells is one of the most important problems in the field of cancer research. Rapid identification of breast cancer has important significance for early diagnosis of breast cancer and improvement of cure rate. In recent years, the RFD model and aptamer technology have been used to fast, accurately and highly sensitive detect specific binding targets. Therefore, these technologies have the potential useful as molecular probe for specific tumor cell identification. In this reaearch, the metabolic mixture of breast cancer cells are as study object, using RFD model and aptamer SELEX screening technology, we wish to obtain specific aptamen probe for different breast cancer cells. The aims of the research are to achieve specific detection of different subtypes of breast cancer cells, establish new detection technology to identify different breast cancer cells, study the interaction mechanism of molecular probe and potential targets. The research results not only provide new technical method for the early detection and diagnosis of breast cancer, but also establish the theoretical foundation for the reveal of the pathogenesis and new biomarker of breast cancer. So that, the research has important scientific significance and social value.

肿瘤细胞的识别鉴定是目前肿瘤研究领域的重要问题之一。乳腺癌细胞的快速识别检测对于乳腺癌的早期诊断和提高乳腺癌疾病的治愈率具有重要意义。近年来，利用选择性剪切DNA 中嵌入的RNA 碱基的标记DNA 酶（ RNA-cleaving Fluorescent DNAzymes, RFD）模型和适配体技术，可快速、准确、高灵敏的检测与其特异性结合的靶标，因而具有作为特定肿瘤细胞识别鉴定的分子探针的潜质。本课题以乳腺癌细胞的代谢混合物为研究对象，采用RFD 模型及适配体SELEX 筛选技术，筛选获得针对不同乳腺癌细胞的特异性适配体分子探针，实现乳腺癌细胞及乳腺癌不同亚型细胞的特异性检测，建立识别不同乳腺癌细胞的新型检测技术，探讨分子探针与潜在靶标的作用机制。研究结果不仅为乳腺癌早期检测诊断建立新的技术方法，还可为新的乳腺癌标志物的发现及乳腺癌发病机理的揭示奠定理论基础，具有重要的科学意义和社会价值。

乳腺癌是全世界的女性中发病率最高的癌症。早期检测对于降低乳腺癌患者的死亡率至关重要，然而由于当前缺乏有效的识别早期乳腺癌的肿瘤生物标志物，乳腺癌早期检测的手段的准确性还稍显不足，因此不能对乳腺癌进行有效的早期诊断。具有RNA剪切功能的荧光脱氧核酶（RNA-cleaving fluorogenic DNAzymes，RFDs）是一种具有催化剪切RNA功能的DNA分子，可以通过与特定的靶标结合产生催化作用，并利用RNA的剪切产生增强的荧光信号。RFD分子可以通过指数富集的系统配体进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX）过程获得。本研究主要围绕与乳腺癌相关的荧光标记功能核酸，建立了针对乳腺癌及其相关分子的新型检测技术。首先利用SELEX过程筛选出可以对乳腺癌细胞MDA-MB-231产生应答的RFD分子探针。该探针可以对低至5,000 cell/mL细胞蛋白进行检测。利用蛋白酶解的方式证明其靶标为蛋白分子，分子筛截留蛋白实验确定其靶标蛋白分子量为50 kDa以上。探针可以对MDA-MB-231细胞与其他细胞系进行区分，包括正常细胞、其他类型的肿瘤细胞，甚至其他乳腺癌细胞亚型。其次，针对T47D细胞培养液筛选获得的探针可以检测低至500个细胞每毫升T47D培养浓度。此外，针对MDA-MB-231的探针可以对90%以上的临床乳腺肿瘤组织样本产生应答。最后，我们对分子探针的反应条件及序列进行的深度优化，优化之后的新探针，具有更短的序列，更低的检测限和良好的特异性，这使得RFD探针能够实际应用到临床的检测当中，提供了有力的支撑。本研究首次实现了可检测肿瘤细胞的RFD分子的筛选，表明RFD今后在临床诊断和治疗中具有应用的潜力，为进一步开发基于此的乳腺癌筛查检测试剂盒奠定了基础。