海带ROCO和NB-ARC类抗病基因的克隆和表达特征研究

The published genome sequence and the unveiled disease resistance gene families (ROCO-LRR and NB-ARC-TPR genes) in the filamentous brown alga Ectocarpus siliculosus lay a foundation for mining the disease resistance genes in Saccharina japonica (Laminariales), and also gave a clue to the investigation of the molecular mechanism of the innate immune system in the commercially exploited kelp. In this project, bioinformatics analysis will be made to obtain the conserved domains of the disease resistance genes in brown algae, basing on the resistance gene families in E. siliculosus and some related expressed sequence tags (EST) in other brown algae (Fucus, Laminaria, Ectocarpus and so on). Resistance gene analogs (RGAs) of ROCO-LRR and NB-ARC-TPR genes will be isolated from S. japonica using degenerated primers designed according to the ROCO and NB-ARC conserved domains, respectively. Phylogenetic analysis will performed to give the evolutionary relationships of these RGAs. Based on the isolated RGAs, at least three full-length cDNA of each resistance gene class will be cloned by using the method of the rapid amplification cDNA ends (RACE). The expression profile of six resistance genes cloned will be analysed by quantitative RT-PCR and western blot to show whether they will be induced after infection of Altermonas sp. or oomycetes in young sporophytes and gametophytes. This project will not only shed light on the function of disease resistance genes and the molecular mechanism of the innate immune system in S. japonica, but also offer theoretical foundation to the breeding of the disease-resistant Saccharina cultivars and the understanding of molecular mechanism in kelp diseases.

大型褐藻模式物种长囊水云全基因组测序的完成和其先天免疫系统相关基因家族的挖掘，为海带抗病基因克隆提供了线索和依据，也为探索海带先天免疫系统的分子机制奠定了基础。本研究拟通过生物信息学技术分析长囊水云ROCO-LRR和NB-ARC-TPR类抗病基因家族的保守结构域及其它大型褐藻EST中具有相似结构的基因序列，设计兼并引物，依据同源序列法克隆海带基因组中ROCO和NB-ARC类基因的同源序列，并分析其结构特点和进化关系；通过RACE技术等分别克隆3条以上的ROCO-LRR类和NB-ARC-TPR类全长抗病基因，并通过定量RT-PCR和Western blot技术分析这些基因在海带幼孢子体和配子体感染细菌（褐藻酸降解菌）或卵菌前后的表达变化，探索ROCO和NB-ARC类基因在海带不同世代、感染不同病原微生物的表达特征。本项目有利于深入了解海带先天免疫防御系统的分子机制，为海带抗病育种提供理论基础

随着海洋环境的变化，连续几年我国最重要的经济褐藻海带连续发生规模性病烂，导致严重的减产和经济损失，海带病害已成为制约海带产业良性发展的一个重要问题。为了认识海带的主要病害，了解海带先天免疫防御系统的分子机制，本研究通过生物信息学、分子生物学、生理生化等不同学科的技术方法，探索海带ROCO和NB-ARC类抗病基因的结构特征、进化特点和表达特征。研究发现：（1）海带不同世代和孢子体生长的不同阶段都会发生病害，海带病害的发生与环境条件的变化密切相关，如海水温度的升高会导致海带孢子体不健康，更易遭受细菌和真菌的入侵而发病；（2）通过分析生产一线抗病海带品系和疾病敏感海带品系的生化指标发现，孢子体阶段热胁迫可以加剧疾病敏感海带的发病速度；疾病敏感海带品系在热胁迫早期积累更多的活性氧，脂质过氧化程度也更高，随后其光合效率明显比抗病海带品系低；（3）获得34个LRR-ROCO蛋白基因，其中5个为假基因，海带抗病基因呈现串联排列，LRR-ROCO抗病基因的串联排列是这个基因家族基因扩张的证据，这一点与长囊水云ROCO基因排列特点相似；（4）选取27个完整的海带LRR-ROCO蛋白基因，基于海带和长囊水云ROCO结构域的氨基酸序列，构建NJ系统进化树，海带和长囊水云的ROCO结构域分为3个亚型：在ROCO-A进化枝中，海带不同于长囊水云，ROCO基因没有较大数量的扩增，多样性也较低；在ROCO-B进化枝中，海带ROCO-B型基因较长囊水云扩增明显，说明海带和长囊水云ROCO基因的进化方向不同；在ROCO-C进化枝中，海带ROCO-C型基因与长囊水云ROCO-C型基因数量差别不大；（5）在海带基因组中总共发现300多个LRR结构域，每个LRR有24个氨基酸组成，海带抗病基因的LRR进化速率较快，这可能与其作为识别海带病原配体有密切关系；（6）海带抗病基因在海带配子体感染卵菌过程中存在表达差异，说明海带抗病基因是受病原感染调控的，存在组成型表达和选择型表达的差异，更为重要的发现是海带LRR-ROCO抗病基因存在选择性剪接，这一发现表明海带抗病基因在mRNA前体中通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体，抗病基因可变剪接产生的不同的mRNA编码框，可产生多种蛋白质。本项目的研究成果为深入了解海带先天免疫防御系统的分子机制和筛选抗病海带种质材料提供理论基础，具有重要的科学意义。