多靶细胞垂钓结合事件驱动迭代反馈的药对协同增效成分群发现及配比优化

Notopterygii/Angelicae Biseratae herb couple has significant clinical effects on rheumatoid arthritis (RA). In preliminary study, we found that the herbal couple can successfully inhibit experimental RA of rats induced by Freunds-adjunvant and showed significant synergistic effect. However, the synergistic active components are unclear, and the proportion of Notopterygii and Angelicae Biseratae remains unknown, which urgently need for further investigation. This project intends to use Notopterygii/Angelicae Biseratae herb couple as research vehicle. Ligand fishing assay with online comprehensive two-dimensional liquid chromatography/target membrane chromatography-mass spectrometry method is adopted based on the characteristics of “multi-component, multi-pathway” of herbal couple and the pathological features of “multi-factorial etiology, multi-pathogenesis” of RA. Event-driven target cell model in vitro is used to evaluate the contribution of the coordination of the combination. Chou-Talalay means integrated with casual-based STEP-CARD algorithm is conducted to screen the active components from vehicle. Using reasonable experiment design/nonlinear modeling/multi-objectives method to optimize the proportion of active components, and the synergistic combination (SC) with appropriate compounds number, clear structures and exact proportion can be obtained. Using target cell iteration feedback strategy driven by hypoxic event to investigate into SC synergistic compatibility principle and its mechanism(s) based on PI3K/AKT/mTOR and HIF-1α pathways. This project can provide more evidences for the discovery of TCM synergistic components the mechanism(s) studies.

羌活-独活药对治疗类风湿关节炎（RA）临床疗效确切。前期研究发现药对可显著对抗完全弗氏佐剂致大鼠实验性RA，且表现出显著的协同增效作用，但协同增效成分群不明，配比不清，有待研究。本项目以羌活-独活药对为研究载体，基于中药“多组分、多途径”的作用特点和RA疾病“多病因、多病机”的特征，采用在线全二维液相色谱/靶细胞膜色谱-质谱联用的亲和垂钓技术，利用事件驱动的体外靶细胞模型进行组分配伍协同作用贡献度评价，通过Chou-Talalay法结合基于因果关系的STEP-CARD算法，辨识药对中的协同增效成分群；根据合理实验设计-非线性建模-多目标优化策略进行配比优化，得到个数一定、结构明确、配比清楚的协同增效组分配伍组合（SC）；基于PI3K/AKT/mTOR和HIF-1α通路，采用缺氧微环境事件驱动的靶细胞迭代反馈策略探讨SC协同配伍规律及作用机理，为中药配伍协同成分群发现和作用机理研究提供借鉴。

类风湿关节炎（RA）是一种是以滑膜细胞增生、多种炎症细胞浸润、微血管新生以及血管翳形成、关节软骨、骨破坏为主要病理特点的自身免疫性疾病，主要临床表现为关节痛、晨僵、关节畸形、多滑膜炎和关节外病变。我国患病率约为0.32%～0.36%，略低于0.5%～1%的世界平均水平，男女患病比率为1∶3，发病高峰在30～50岁，是造成人类劳动力丧失和致残的主要因素之一。中医治疗RA具有丰富的临床经验，且中药具有资源丰富、不良反应小、适用于长期给药的特点。因此，从中药中寻找治疗RA的有效成分或成分组合具有重要意义。本研究采用基线增减法设置独羌药对的不同配伍比例，利用UPLC QTOF/MS和UPLC QQQ/MS对独羌药对化学成分进行了定性定量表征，研究结果表明，药对中化学成分主要是香豆素类化合物，定性研究共鉴定52个化学成分，且单味药与不同比例药对配伍前后不存在化学成分本质的变化；通过体外靶细胞迭代反馈结合文献报道和网络药理学研究，初步筛选出独羌药对中候选活性成分组合并采用UPLC QQQ/MS法对药对中的9个香豆素类化合物进行了定量表征，其中羌活醇和异欧前胡素是羌活特征性成分，蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯是独活的特征性成分。采用靶细胞膜色谱-质谱联用的生物亲和捕集技术，辨识确证得到了个数一定、结构明确、配比清楚的主效成分组合（SC）；通过体外靶细胞模型及体内整体动物II型胶原致类风湿关节炎大鼠模型分别验证了SC组合的体外、体内药理活性作用；结合代谢组学和肠道菌群等多组学技术探讨了羌独药对及其主效成分组合（SC）抗RA的整合作用机制。通过本项目研究，为中药药对主效成分组合发现与整合作用机制研究提供借鉴，兼顾传统中医药理论优势和中药方剂配伍特点，为建立基于谱效关系的组分配伍创新中药的研发理论模式和相关技术体系提供参考，为传统经典“药对”的临床应用和二次开发提供科学依据和数据支撑。