微小RNA基因在二化螟化蛹和羽化中的调控功能分析

微小RNA是一类重要的非编码RNA基因，抑制蛋白编码基因的翻译或降解mRNA，参与调控胚胎发育、细胞分化等许多重要性状，曾被Science杂志多次评为年度十大科学进展之一。昆虫化蛹和羽化是变态发育的重要环节，但分子机制尚不明确。为探索微小RNA在害虫化蛹和羽化中的调控功能，本项目拟以二化螟为研究对象，在已获得229个二化螟微小RNA基因的基础上，通过基因芯片筛查调控二化螟化蛹或羽化的微小RNA，利用定量PCR进行验证，RACE扩增微小RNA基因全长，利用全长序列设计siRNA，对微小RNA基因进行干扰，观察其对化蛹或羽化的影响，进一步预测微小RNA的作用靶标并利用荧光素酶载体系统、RNA干扰技术进行验证。利用生物信息学方法构建综合激素、蛋白编码基因、微小RNA等不同调控因子的二化螟变态发育调控通路。研究成果不仅具有科学的理论意义，也为有效获得昆虫特异性基因并安全应用于害虫防治提供重要基础。

微小RNA基因是重要的非编码RNA基因，在动物中主要通过序列互补配对抑制蛋白基因的翻译来实现转录后调控，参与调控细胞分化、免疫和发育等许多重要性状。但是，微小RNA基因在昆虫化蛹和羽化中的调控功能尚不明确。本项目在此背景下，2012年立项，开展的主要研究内容包括：对二化螟微小RNA基因在不同发育时间点的表达情况进行基因芯片分析，检测发现在不同发育时期明显差异表达的微小RNA基因，然后预测微小RNA基因的靶标，利用双荧光素酶报告载体对靶标进行验证，设计mimics和inhibitor进行干扰或过表达，检测其对靶标基因蛋白水平的影响，观察表型变化，明确微小RNA基因对二化螟化蛹或羽化的调控作用。项目经过四年的实施，顺利完成了预定的研究内容，取得一些重要的研究成果，主要包括：1）利用小RNA基因芯片平台，检测了二化螟 miRNA 基因在老熟幼虫、预蛹、早期蛹、复眼形成时期、跗节形成时期、蛹体拉伸时期和成虫等7个发育时间点的表达情况。结果表明，54个miRNA基因在不同发育时期差异高表达。2）利用miRanda软件对差异表达的 miRNA 基因进行了靶标预测，共得到 2,116 个靶标基因。 KEGG分析发现，在早期蛹时期受miRNA基因调控的蛋白编码基因主要为氨基酸代谢、聚糖的生物合成和代谢、碳水化合物代谢等3个通路中的基因。3）选择miR-277、miR-6094 和 miR-275 等3个 miRNA基因进行功能分析，其中miR-277作用于成虫盘生长因子，过表达miR-277导致30%的个体跳过预蛹阶段，直接进入蛹期，表明miR-277参与调控二化螟化蛹发育。而干扰或过表达miR-6094和miR-275对二化螟发育没有明显的影响。4）对miRNA与其靶标基因的表达量进行了共表达分析，发现了8个miRNA和10个mRNA的互作模块，表达量正相关的csu-miRNA和mRNA为46个和205个，表达量负相关的csu-miRNA和mRNA为39个和110个。对 SLC基因家族的分析表明，SLC25A27与csu-miR-11的表达量负相关，7个SLC基因与相应的csu-miRNA呈正相关。上述研究结果系统地发现了参与调控二化螟发育的微小RNA，研究了3个微小RNA的功能，对阐明昆虫变态发育的分子机制具有重要的科学意义。