苹果轮纹病生防菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens PG12 Iturin A 与定殖的相关性研究

Apple ring rot disease, caused by Botryosphaeria dothidea, was one of the most important diseases on apple fruits in Asia. The preliminary study of this topic indicates that Bacillus amyloliquefaciens PG12 was one of high antagonistic Bacillus strains isolated from Fuji apple fruits against B. dothidea. Iturin A production by B. amyloliquefaciens PG12 plays a major role in this disease suppression. Iturins were at first mostly studied for their antagonistic activity for a wide range of potential phytopathogens. Recent investigations have shed light on the fact that these iturins can also involved at different levels of the colonization process, which is the precondition to be successful in field application of biocontrol agents. In this study, we aim to explore the relationship between Iturin A and colonization of B. amyloliquefaciens PG12 relying on the way of reverse genetic methods, including ituD disruption and functional complementation, antifungal activity detections in vitro and the analysis of colonization related characters. These results will further demonstrate the role of Iturin A on the colonization process. This study not only helps to reveal the molecular mechanism of colonization in the apple, but also helps to further study the bio-control mechanism of Bacillus.

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12是从苹果果实中分离获得的对苹果轮纹病（Botryosphaeria dothidea）有良好防效的有益细菌，产生具有抑菌活性的脂肽类化合物Iturin A是其重要的生防机制。关于Iturin A的研究，主要集中在抑菌活性方面，而它与定殖的相关性研究较少。本项目以B. amyloliquefaciens PG12为研究对象，拟通过反向遗传学研究途径，利用基因敲除和功能互补验证等功能基因组学研究方法，结合运动性、生物膜、在苹果果实上定殖量的测定和定殖位点的观察，探究Iturin A与B. amyloliquefaciens PG12在苹果果实上定殖的相关性。本项目不仅有利于揭示解淀粉芽孢杆菌在苹果上定殖的分子机制，而且有助于深入研究解淀粉芽孢杆菌的生防机理。

芽胞杆菌以其在植物体内、根际、土壤等自然环境中广泛存在，能够产生抗逆的芽胞、多样的抗菌代谢产物，能够有效地定殖在植物体内并保护植物免受病原菌侵染，被认为是一种环境友好型、应用前景广的生防细菌。解淀粉芽胞杆菌是其中一类具有生防潜力的细菌，已经成功应用于多种植物采后病害的防治。苹果轮纹病（Botryosphaeria dothidea）是苹果采后重要病害之一，在中国苹果园区普遍发生。本研究首次以苹果轮纹病为靶标，以生防解淀粉芽胞杆菌PG12（B. amyloliquefaciens PG12）为研究对象，为了揭示PG12防治苹果轮纹病的主要生防机制，利用分析化学和分子生物学手段探究其主要抑菌活性物质，以及该活性物质对定殖相关的多细胞行为的影响，为苹果轮纹病生物农药的开发提供重要的理论指导。 1）B. amyloliquefaciens PG12 是一株对苹果轮纹病有良好生防效果的菌株。 B. amyloliquefaciens PG12在苹果果实上对苹果轮纹病菌丝和孢子的抑制效果显著。无论在采前还是采后施用，B. amyloliquefaciens PG12在一定的储藏期内能够减小苹果采后病害的发生。在平板拮抗试验中，B. amyloliquefaciens PG12对苹果轮纹病菌丝生长有明显抑制作用，产生显著的抑菌圈。通过扫描电子显微镜（scanning electronic micrographs，SEM）观察发现，靠近抑菌圈的真菌菌丝畸形，初步推测PG12可能通过产生一些抗菌代谢产物抑制真菌生长。 2）脂肽类抗生素是 B. amyloliquefaciens PG12 抗苹果轮纹病主要的抑菌活性物质。 为进一步阐明B. amyloliquefaciens PG12对苹果轮纹病的主要生防机制，以抗菌代谢产物为切入点，深入探究代谢产物的抑菌活性。PG12无菌上清液中抑菌活性物质在紫外线、蛋白酶K、高温、强酸碱条件下较稳定。进一步研究发现，理化性质稳定的脂肽类抗生素是B. amyloliquefaciens PG12抑制苹果轮纹病菌菌丝和孢子的主要抗菌活性物质。经PCR检测，在B. amyloliquefaciens PG12基因组上含有脂肽家族伊枯草素、丰原素和表面活性素的关键合成基因。采用薄层层析（thin layer chromatography，TLC）-生物