肝素在脓毒症内皮细胞损伤中调控MyD88依赖的TLR-4途径炎症基因表达的作用机制研究

脓毒症是ICU患者最主要的死亡原因，近年研究表明脓毒症的主要特点是微循环功能障碍。微循环功能障碍的病理生理过程分成两个部分:由于高凝状态导致的 血栓形成和血管内皮细胞功能障碍。脓毒症时内皮细胞发生活化，生成促凝及抑制纤溶物质增多，并且白细胞和血小板滚动并粘附到受损的内皮细胞表面，从而炎症和凝血发生了，并相互作用，最终导致微血管的阻塞，微循环出血和组织循环状态恶化，因此内皮细胞在脓毒症的发生发展过程中起到关键作用。活化蛋白C是目前唯一经大样本国际性研究证实可以降低脓毒症患者病死率的抗凝剂，后期研究表明可能与其复杂的抗凝，抗炎，抗凋亡作用相关，肝素具有相似的生物学活性且价格低廉，因此可能发挥和活化蛋白C相似的作用。NF-κB作为公认的转录因子，负责200多种基因的转录，在炎症过程中起到核心作用。本研究旨在明确不同浓度普通肝素对内皮细胞的抗炎作用，及NF-κB通路在其发生机制中的作用。

课题开展的3年时间里，我们首先研究了LPS诱导内皮细胞损伤后发生的炎症反应，LPS刺激后，内皮细胞表达IL-1β和IL-6增多，2小时达到高峰，表达E-选择素和ICAM-1增多，6小时达到高峰，LPS刺激后P38 MAPK磷酸化增加，NF-κB向细胞核内转移。肝素预处理减少了P38 MAPK磷酸化和NF-κB的核移位，进而减少了炎症介质的表达，抑制了LPS诱导内皮细胞发生的炎症反应，发挥对内皮细胞的保护作用，该文章发表于cytokine。我们进一步研究上游信号通路，发现肝素抑制PI3K/Akt/NF-κB途径发挥抗炎症作用，该文章发表于Immunobiology。炎症过程一方面是炎症因子释放，另一方面趋化因子表达增加，我们研究发现肝素可以通过KLF5/NF-κB途径抑制LPS诱导的趋化反应，该文章发表于Immunobiology。为了深入研究肝素的抗炎作用机制，我们构建了“沉默”IκBα基因载体。IκBα基因沉默后NF-κB表达增加，其下游的炎症因子和趋化因子表达增高，加入LPS后进一步加剧炎症反应，我们延长肝素预处理时间至3小时和6小时，肝素减少了IL-6、IL-8和IL-1β的表达，抑制NF-κB的活化，同时减少p38 MAPK、ERK MAPK及c-Jun AP-1的表达，免疫荧光结果证实肝素通过非经典途径抑制NF-κB的核移位，进一步通过DNA-binding证实，肝素抑制NF-κB的DNA结合能力，以UFH 10U/ml作用6小时效果最明显，从而充分说明肝素可以通过NF-κB途径发挥抗炎作用。提到炎症，除了炎症因子，一定涉及细胞通透性和组织水肿。LPS作用后内皮细胞通透性增加，肝素预处理减少F-actin应力纤维的形成，减少细胞间间隙，减少了ZO-1的表达，从而改善了内皮细胞屏障功能，该文章发表于Thrombosis Research。得到了多方面细胞研究结果支持，我们又进行动物研究探讨肝素在体内的抗炎作用。LPS诱导脓毒症急性肺损伤大鼠模型，静脉注射LPS后，通过病理证实模型构建成功，大鼠肺组织水肿增加，通透性增高，NF-κB发生核移位，并活化了下游炎症因子。静脉注射肝素通过抑制NF-κB减少血浆中IL-1β及IL-6释放。该文章发表于Inflammation。肝素对血管基底膜具有保护作用，相关文章发表于中国危重病急救医学杂志和中国病理生理杂志。