NET相关组蛋白调控脓毒症内皮细胞损伤及肝素保护作用的机制研究

Sepsis is the main cause of death in the ICU and microvascular dysfunction plays a pivotal role in the development of multiple organ dysfunction syndrome in sepsis. The basic pathogenesis of microcirculatory dysfunction can be divided into two parts: microthrombi formation and endothelial dysfunction.When infectious bacteria invade the bloodstream, systemic activation of inflammation leads to cytokine release and endothelial activation and dysfunction, resulting in production of pro-coagulant mediators and platelet adhesion to the subendothelial surface. Thus, the close interplay between inflammation and coagulation results in microvascular occlusion and tissue microcirculatory failure. Thus endothelial cells play a central role in the poor prognosis of sepsis. Recent studies indicate that thrombosis plays a major role in early immune defense against invading pathogens in sepsis. This defensive role of thrombosis is now referred as immunothrombosis which limits invading pathogen to local site. Although NET-mediated immunothrombosis plays a role in early host defense against bacterial dissemination, uncontrolled immunothrombosis may lead to microcirculatory dysfunction. Heparin has the combined effects of anticoagulation and anti-inflammation for the treatment of sepsis, but whether it has effects on NET and immunothrombosis is not clear. And what's the proper initiation time for heparin in sepsis needs to be evaluated. Thus, we investigated the toxic effects of NET and histone on pulmonary endothelial cells in septic mice in vivo and in vitro. We also examined the mechanism of protective effects of heparin and the proper initiation time to provide theoretical basis for the treatment of septic patients.

脓毒症是ICU患者最主要的死亡原因，主要特点是炎症刺激下的微循环功能障碍，其病理生理过程分成两部分：由于高凝状态导致的血栓形成和血管内皮细胞功能障碍。脓毒症时内皮细胞发生活化，生成促凝及抑制纤溶物质增多，且白细胞和血小板滚动并粘附到受损的内皮细胞表面，从而炎症和凝血相互作用，并形成恶性循环，最终导致微血管栓塞和组织循环状态恶化，因此血管内皮细胞在脓毒症的发生发展过程中起到关键作用。近年研究表明早期血栓形成参与机体防御病原菌的免疫过程，使病原菌局限于感染部位，称为免疫血栓，其中NET起到关键作用，但免疫血栓大量形成导致微循环功能障碍。肝素具有抗炎和抗凝作用，但是否对NET及免疫血栓有作用，以及具体应用时机并不清楚。因此，本研究以脓毒症实验小鼠为研究对象，并进行细胞研究，从分子水平探讨脓毒症过程中NET及组蛋白对肺脏炎症和凝血的影响，以及肝素的作用机制和时机，旨在为脓毒症患者救治提供理论依据。

在课题开展的四年时间里，我们首先进行了动物研究，证实脂多糖（LPS）刺激后细胞因子释放增多，TLR-4表达增高，普通肝素（UFH）降低LPS诱导的TLR-4表达进而减少炎症因子的水平。UFH能够降低脓毒症小鼠血清及肺组织中NETs水平。脓毒症时总组蛋白（H）、H3、H4增高，肝素降低组蛋白水平。组蛋白刺激小鼠构建损伤模型，给予致死剂量75mg/kg组蛋白后，小鼠出现明显呼吸窘迫伴口鼻出血，1小时内全部死亡。而给予75mg/kg组蛋白后立即给予UFH 800IU/kg，小鼠7天全部存活。UFH减轻组蛋白造成的肺病理损伤，减轻肺水肿，减少肺纤维蛋白沉积、降低TF、vWF及PAI-1表达、增加TM表达，减轻肺内皮细胞损伤。组蛋白刺激导致肠道浆膜层和粘膜层均发生明显的微循环障碍，应用UFH后灌注微血管增多，血流瘀滞现象明显改善。同时UFH减轻组蛋白造成的肠微血管内皮细胞损伤。.我们进而进行体外研究。分离健康人外周血中性粒细胞，PMA刺激NETs生成，加入人内皮细胞，发现NETs含量越高细胞损伤越重。UFH减轻NETs对内皮细胞的损伤，呈剂量依赖性。通过体外内皮细胞研究，发现UFH抑制组蛋白刺激内皮细胞vWF的产生和释放，并抑制细胞外钙离子内流。为深入探讨UFH抗炎作用机制，构建“沉默”IκB-α基因载体。IκB-α基因沉默后炎症反应上调，再加入LPS后进一步加剧炎症反应，UFH减少IL-6、IL-8的表达，抑制NF-κB活化，减少ERK、p38 MAPK及c-Jun AP-1表达，免疫荧光证实UFH通过非经典途径抑制NF-κB核移位，并抑制NF-κB的DNA结合能力。我们还研究了UFH对LPS诱导单核细胞损伤的保护作用。UFH通过抑制IκB-α、c-Jun、ERK、JNK、p38 MAPK磷酸化及抑制NF-κB核移位减少TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18水平，并抑制LPS刺激下内皮细胞MCP-1的生成，进而抑制单核细胞与内皮细胞的黏附。.通过四年的研究，我们的结果证实了假设，UFH抑制NETs、组蛋白造成的肺炎症和凝血的活化，抑制炎症细胞和内皮细胞的黏附，并探讨UFH的作用时机，为UFH在脓毒症患者中的应用提供充分的理论依据。研究期间发表SCI共5篇，累计IF分值近16分，国内文章2篇，培养硕士生3名，协助培养博士生1名，达到预期目标。