HIV-1潜伏细胞中特异性微小RNA鉴定及其功能分析

人类免疫缺陷病毒（HIV）难以在体内被完全清除的一个重要原因是由HIV潜伏细胞构成的病毒储藏库的长期存在,而HIV潜伏细胞又是如何形成及维持的机制迄今仍未阐明。为此, 本研究拟利用已建立的HIV-1潜伏细胞模型，应用基因芯片技术筛选出HIV-1潜伏细胞中差异表达的miRNA并对其进一步验证；利用生物信息学方法，对筛选出的miRNA靶基因进行预测，尤其是对预测出可能与HIV-1 3′UTR作用的miRNA进行靶点验证。针对验证出的多个miRNA，合成相应miRNA 模拟物和抑制剂并分别导入潜伏细胞等模型上，检测病毒蛋白表达水平,探讨miRNA对HIV-1病毒产生、感染尤其对潜伏的影响。最后，在HIV-1感染者的静止CD4+T细胞中进行miRNA的表达及其对病毒潜伏影响的确认。本申请旨在筛选并鉴定出新的具有参与调控HIV-1潜伏功能的miRNA，以及初步揭示HIV-1潜伏的表观遗传学机制。

人类免疫缺陷病毒（HIV）难以在体内被完全清除的一个重要原因是由HIV潜伏细胞构成的病毒储藏库的长期存在,而HIV潜伏细胞又是如何形成及维持的机制迄今仍未阐明。为此， 本研究在潜伏感染细胞系中利用芯片及 qRT-PCR方法通过比较HIV-1潜伏感染细胞及HIV-1感染细胞和未感染细胞中miRNA的表达差异，筛选出54个在潜伏感染细胞上特异上调或下调的miRNA；利用miRNA 靶点预测网站，又对54个显著性差异的miRNA的作用靶点进行预测，发现有12个miRNA作用于HIV 3’UTR，其中有2个（miR-150）的功能已被报道证实与HIV潜伏有关，从侧面提示了我们数据的可靠。通过miRNA靶点预测软件寻找在HIV-1 LTR可能存在的靶点，最终确定6个可能参与HIV-1表达调控的候选miRNA：hsa-miR-196b，hsa-miR-29b，hsa-miR-1290，hsa-miR-320a，hsa-miR-223，hsa-miR-378*。为了检验这些miRNA能否调控HIV-1的表达，构建包含HIV-1 3’ UTR的荧光素酶报告质粒，与miRNA的模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）共转HEK-293细胞，结果显示通过miRNA的模拟物上调表达miRNA，能够有效地抑制荧光素酶的表达水平，相反，通过miRNA的抑制剂下调表达miRNA后，荧光素酶表达水平明显升高，其中hsa-miR-196b和hsa-miR-1290对于HIV-1 3’ UTR驱动的荧光素酶表达水平影响较大。进一步在HEK-293T及艾滋病人外周血细胞中证实了hsa-miR-196b和hsa-miR-1290HIV对病毒产生及感染有作用。总之，我们 发现细胞内2个MiRNA（miR-196b and miR-1290）具有调控HIV潜伏的作用，不仅有助于阐明HIV-1潜伏感染的表观遗传学机制，重要的是将为HIV-1潜伏的干预治疗提供新的潜在靶点，为病毒潜伏储藏库清除的原创性治疗方案提供新的思路。