耐辐射异常球菌转录调控蛋白CarD参与辐射氧化胁迫反应调控机制的研究

CarD is a global transcriptional regulator involved in a variety of cellular processes, which plays essential roles for transcription, replication, recombination, or repair. The extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans has a CarD homologous protein. Our previous study showed that D. radiodurans CarD has multifunctional roles in radiation, oxidation and starvation stress responses. However, some functions of D. radiodurans CarD differed from that of CarD from Stigmatella aurantiaca or Mycobacteria）, propably exists a new regulationary mechanism in D. radiodurans. And the related research on D. radiodurans CarD has not been reported yet. In this study, we will identify the inducible type of the transcriptional regulator CarD by RT-PCR assay under different stress (UV radiation, Oxidation etc.) conditions in D. radiodurans; To detect the regulators (or factors) control the expression of CarD in IrrE, RpoE and DrRRA deletion mutants. Combining the data of the genome-wide transcriptome analysis (being performed ) between the wild type and a carD mutant under UV radiation stress, to obtain new insights into the comprehensive function of CarD, We will demonstrate that the interaction between CarD protein and the promoter sequences of the genes involved in oxidative or UV radiation stress response, and the interaction between CarD and transcription factors by gel shift assay or Chromatin immunoprecipitation assay (ChIPSeq) and two-hybrid assay. Try to identify the regulatory pathway, to elucidate the regulatory mechanism of CarD in response to radiation, oxidation and starvation stress.

CarD一类全局调控转录因子，在DNA复制、重组、修复以及基因转录等生物过程中发挥着重要的作用。耐辐射异常球菌是地球上最耐辐射的生物之一，其含有一个类似于CarD的同源基因。前期研究工作显示辐射异常球菌CarD与辐射、氧化和饥饿等胁迫反应相关，具有多重生物学功能，与已报道分枝杆菌及粘细菌的CarD功能存在差异，可能存在一种新的调控机制，目前尚无相关研究报道。本研究拟研究辐射氧化等胁迫条件下的CarD蛋白表达，确定其诱导类型，分析其在IrrE、RpoE、DrRRA等全局调控蛋白（因子）突变株中的表达确定上游调控因子；结合正在进行的转录组学分析数据，全面了解CarD功能；利用凝胶阻滞电泳和ChiPseq技术及酵母双杂交系统，研究调控蛋白CarD与相关基因启动子序列以及与转录因子、调控蛋白之间的相互作用，确定CarD的调控途径。探讨和阐明CarD参与辐射、氧化和饥饿胁迫反应的调控分子机制。

CarD一类全局调控转录因子，在DNA复制、重组、修复以及基因转录等生物过程中发挥着重要的作用。耐辐射异常球菌是地球上最耐辐射的生物之一，其含有一个类似于CarD的同源基因。前期研究工作显示辐射异常球菌CarD与辐射、氧化和饥饿等胁迫反应相关，具有多重生物学功能，其分子调控机制尚无相关研究报道。本研究利用RT-PCR分析测定了不同条件下CarD基因及其相关基因的转录表达，结果表明CarD基因受UV辐照、氧化、饥饿的诱导。IrrE基因表达下调，表明CarD可能受全局调控因子IrrE的调控。为了研究CarD的生物学功能，我们构建了CarD突变株、过量表达菌株和原位回补菌株，胁迫冲击实验及生长曲线测定结果表明CarD突变导致菌株对饥饿、氧化（H2O2）、高温（48℃）敏感，引起对UV辐射抗性的增强。进一步通过转录组学分析、ChiPseq技术、酵母双杂交分析以及lacZ 融合到启动子下游后的β半乳糖苷酶活性测定，数据显示参与细胞生长和营养胁迫反应，以及氧保护、DNA修复等多种生理过程的调控；具有与RAN聚合酶β’亚基互作，并激活16S rRNA和(p)ppGpp合成/水解酶基因relA的转录表达。研究结果表明CarD结合RAN聚合酶β’亚基，并直接调控16S rRNA以及relA基因表达，通过介导核糖体RNA的合成以及信号分子(p)ppGpp参与的严紧反应，调节细胞在营养胁迫下生长速率以及UV、氧化、热等胁迫反应。本研究阐明耐辐射异常球菌CarD的生物学功能以及分子作用机制，对于揭示耐辐射异常球菌的环境适应机制，了解DNA损伤修复机制有着十分重要意义。