srGAP3向细胞核转位介导神经元死亡的作用及其机制

神经元死亡是急性和慢性神经退行性疾病的共同病理特征，阐明神经元死亡机制是揭示疾病发生本质和神经保护治疗的关键。srGAP是近年发现的在神经元发育和迁移中起重要作用的蛋白家族，我们的前期工作发现了srGAP3的新功能- - 介导神经元死亡，进一步研究发现srGAP3在神经元受到死亡诱导刺激后从胞浆转位到细胞核。促死亡蛋白的亚细胞定位对其功能至关重要，因此srGAP3的核转位及介导细胞死亡的机制是本项目研究的核心问题。我们拟在在体和离体海马神经元死亡模型上，采取功能增强和功能缺失策略，利用分子生物学技术构建一系列相关结构域的缺失表达、突变表达、过表达以及RNA干扰质粒，转染神经元后观察不同结构域在srGAP3蛋白核转位中的作用和对神经元死亡的影响，并寻找srGAP3作用的下游信号分子。本研究将阐明srGAP3介导神经元死亡的新功能和新机制- - 向细胞核转位，为神经保护治疗寻找到新干预靶点和理论依据。

神经元死亡是急性和慢性神经退行性疾病的共同病理特征，阐明神经元死亡机制是揭示疾病发生本质和神经保护治疗的关键。srGAP是近年发现的在神经元发育和迁移中起重要作用的蛋白家族，其在成年动物海马中仍维持高水平的表达。本项目研究了srGAP3蛋白在神经元死亡中的作用并探讨了其可能机制。我们采用谷氨酸诱导的培养海马神经元死亡模型，发现谷氨酸引起全细胞水平srGAP3蛋白表达下调，慢病毒shRNA干扰srGAP3表达可以保护谷氨酸诱导的神经元死亡，提示兴奋毒刺激后有可能激活了某种机制下调srGAP3从而保护细胞，或是srGAP3的细胞定位发生改变，在特定部位的变化才是介导神经元死亡的重要机制。进一步研究srGAP3在兴奋毒刺激后在亚细胞水平表达定位的变化，结果发现谷氨酸处理后，神经元细胞浆srGAP3表达水平无显著变化，而细胞核srGAP3表达水平显著升高；免疫荧光染色结果也支持srGAP3在谷氨酸刺激后向细胞核转位，说明谷氨酸刺激后细胞核srGAP3水平的升高可能是介导神经元死亡的重要原因。采用NMDA受体阻断剂MK801或memantine均可逆转谷氨酸引起的srGAP3表达改变；反之，采用NMDA刺激可引起与谷氨酸作用类似的srGAP3表达改变；慢病毒shRNA干扰srGAP3表达可以保护NMDA诱导的神经元死亡，这些结果提示srGAP3表达变化是NMDA受体激活导致的。采用KCl或Bicuculine刺激神经元，结果发现这两种刺激均不能引起srGAP3在全细胞蛋白水平和亚细胞蛋白水平（细胞浆和细胞核）的改变，说明srGAP3表达变化是神经病理条件下特异的。上述研究结果表明srGAP3在亚细胞水平表达变化是介导兴奋毒神经元死亡的重要机制，为神经保护治疗寻找新的干预靶点提供了理论和实验依据。