耐辐射奇球菌pprM基因靶RNAs/靶蛋白筛选及其抗辐射调控网络研究

So far on the Earth, Deinococcus radiodurans (DR) is an existing extremophiles which presents the strongest radioresistance ability. Its highly efficient and precise DNA damage repair capacity confers the bacteria super -radioresistance. PprM is a new anti-radiation response gene which could only be found in DR, whose function and position in DNA damage repair regularion network remains unclear.In this study we manipulate RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) and photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP) to screen and identify targeted mRNAs binding to PprM; EMSA and DNA footprinting techniques to clarify whether PprI and PprA play their roles as gene transcription factors of pprM; yeast two-hybrid techniques to determine pprM interacting proteins. The goal of this study is to observe changes of radioresistance and oxidation resistance in DR and heterogeneic cells when we knockout, compensate or insert heterogenous gene and targeted gene we screen from above-mentioned protein-RNA and protein-protein interaction, pprM gene and function domain in pprM gene. We aim to identify functions and roles of pprM gene in the network of pprI-induced radiation damage regulation, or to find a new radioresistance mechnisms of pprM.

耐辐射球菌(DR)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的极端微生物，具有高效精确DNA损伤修复能力。pprM是一种新发现的DR菌特有的抗辐射响应基因，其在DNA损伤修复调控网络中的功能尚不清楚。本研究拟用RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）及光活性增强的核糖核苷交联免疫共沉淀（PAR-CLIP）技术筛选及鉴定PprM蛋白结合的靶mRNAs；EMSA和DNA足纹分析确定PprI、PprA对pprM是否发挥基因转录调控因子作用；利用酵母双杂交技术在本实验室前期构建的耐辐射球菌基因组文库中筛选PprM相互作用蛋白；并对经蛋白质-RNA和蛋白质-蛋白质相互作用筛选到的相关靶基因、pprM基因及其功能结构域行基因敲除、基因回补及异源基因导入研究，观察DR菌及异种细胞辐射抗性和氧化抗性等改变。以明确DR菌pprM基因功能及其在pprI基因诱导的抗辐射损伤调控网络中的地位，抑或发现pprM抗辐射新途径

耐辐射奇球菌(DR)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的极端微生物，具有高效精确DNA损伤修复能力。pprM是一种新发现的DR菌特有的抗辐射响应基因，其在DNA损伤修复调控网络中的功能尚不清楚。本课题紧紧围绕PprM的蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-蛋白质三大相互作用关系展开研究，探究pprM基因的功能及其在辐射损伤调控网络中的定位。首先，利用RNA pull-down技术筛选到4个与PprM蛋白具有相互作用的RNAs，分别对应DR_A0355、DR_0907、DR_0907的5'-UTR和DR_A0234，并证明在体外PprM蛋白与自身mRNA 5'UTR区域具有结合作用。其次，通过染色质免疫共沉淀-PCR(ChIP-PCR)筛选到pprI、recA和pprA基因的启动子区域可与PprM蛋白相互结合。最后，采用酵母双杂交技术证实PprM蛋白能与PprI和PprA蛋白相互作用,并进一步通过细胞共定位实验观察到转基因表达蛋白PprA和PprI可能因为相互结合而在真核293T细胞中呈现共定位，极端条件冲击实验中两者呈现辐射抵抗协同效应。同时，pprM全基因敲除、DNA结合结构域敲除后，观察到耐辐射奇球菌对极端条件（大剂量γ辐照、紫外辐照、过氧化氢、丝裂霉素C、干燥等）的抗性下降。研究结果表明：PprM蛋白通过与DR_A0355的mRNA结合，调节生物体双组分应答调节系统的重要应激感受蛋白（DR_A0355编码蛋白）的表达，有助于DR菌双组分调节系统在辐射环境条件下能快速发挥辐射应激保护作用；PprM蛋白可通过蛋白质-DNA相互作用模式作用于DNA辐射损伤修复调控网络的开关基因pprI的启动子，提示PprM蛋白可调控总开关基因（pprI），这些都说明pprM基因在耐辐射奇球菌的极端辐射抗性中有着举足轻重的作用。