耐辐射球菌irrE增强大肠杆菌抗逆性的分子机制研究

分离克隆可供植物基因工程利用的新基因，研究其耐盐抗旱分子机制是当今转基因植物研究开发和竞争的热点。我们发现耐辐射基因irrE能赋予大肠杆菌及油菜、烟草极高的耐盐能力(达350mM NaCl)，是一类可开发的抗逆性基因资源。由于细菌和植物存在对各种胁迫应答相当接近的机制，为进一步研究抗逆分子机制，本项目以模式菌株大肠杆菌为研究对象，主要针对大肠杆菌胁迫反应的全局转录因子RpoS，甘油、海藻糖渗透保护物质的代谢途径，开展irrE基因对上述基因的转录表达调控的研究。拟通过RT-PCR分析在胁迫条件下与抗逆相关代谢途径的基因转录水平，利用凝胶阻滞电泳或构建共转化系统，分析调控蛋白IrrE与相关基因及转录因子启动子序列的相互作用。探讨和阐明IrrE对这些抗逆基因的调控机制。本项目开展耐辐射基因对大肠杆菌抗逆分子机制的研究，为培育抗逆转基因作物提供新的基因资源及开拓新的途径。

前期研究工作我们发现来自耐辐射异常球菌全局调控蛋白IrrE 能赋予大肠杆菌及油菜、烟草极高的耐盐能力，调控蛋白参与各种胁迫反应中基因调控表达和信号传导，其分子机制并不清楚。本研究以模式菌株大肠杆菌为研究对象，发现IrrE能增强大肠杆菌UV辐射、盐、高渗透、高温等逆境胁迫抗性，蛋白结构分析、截短实验、位点突变实验表明IrrE蛋白的锌依赖型多肽酶、HTH和GAF3个结构域是维持IrrE调控蛋白功能所必需的，IrrE 184位点是UV辐射抗性的关键位点。凝胶阻滞试验显示His-Tag IrrE融合蛋白能非特异结合各种参与胁迫反应相关基因的启动子区序列。转录组学和蛋白质组学数据分析结果表明IrrE参与了细胞核苷酸代谢、碳源代谢、氨基酸代谢、膜上转运载体、氧化还原酶等300多个代谢功能基因的表达调控。此外，多达14个转录调控因子的表达差异，appY, evgA, gadE, gadW, gadX, yhiF 和asnC表达显著上调，betI, cynR, mhpR, prpR, tdcA, kdgR和purR的表达显著下调。导致了细胞内核苷酸合成、碳源利用、氨基酸代谢、细胞内氧化还原酶以及细胞酸抗性调控系统等代谢发生明显改变。推测IrrE作为全局调控蛋白，通过对这些转录因子的调控，转录级联放大反应促进或抑制基因表达，发挥全局调控的作用，整体增强了细胞的抗逆作用。