披碱草氢离子焦磷酸化酶基因 EdHP1 提高植物耐低钾、重金属胁迫的作用机制

Plant H+-pyrophosphatase (H+-PPase) is an active proton pump that energizes many proton gradient-dependent transporters across the different membranes and enhance resistance of plants to some abiotic stresses, which is important for stress-resistant improvement in crops. So far, the regulative mechanism of H+-PPase remains unknown. We have isolated a novel H+-PPase gene, EdHP1, from Elymus dahuricus, a wheat wild relative plant, and proved for the first time that overexpressing EdHP1 can not only enhance resistance of plants to drought or high salt stresses, but also enhance tolerance to low potassium nutrition or heavy metal ion stresses. In this project, we plan to look for the interaction proteins with EdHP1 and then check the phenotypes of those Arapdopsis mutants with the defective genes coding the interaction protein, and validate the relationship bewteen EdHP1 and the interaction proteins by conducting in vitro and in vivo protein interaction experiments, and mutant cross experiment, which will be advantage to clarify relationship and regulative pattern between EdHP1 and interaction proteins and finally illustrate regulative mechanisms of EdHP1. Further, the EdHP1 gene will be transformed into wheat to compare the accumulated content of K+ and heavy metal ion between transgenic and wild type wheat plants, and to identify the change of transporting activation of transporters for different ions on membrane, which will be helpful to explain the physiologic mechanisms of EdHP1 enhancing resistance to some abiotic stresses. On the other hand, the worthiness for molecular breeding of EdHP1 will be evaluated by field trial for yield.

氢离子焦磷酸化酶作为质子泵可以驱动许多依赖于质子梯度的膜转运体活性，提高植物对多种非生物胁迫的抗性，具有重要利用价值。目前，该基因的作用模式及分子调控机制尚不清楚。我们从小麦野生近缘种披碱草中克隆了新的氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1，证明该基因可以提高植物抗旱、耐盐性的同时，首次发现可以提高植物耐低钾、耐重金属铅的能力。本项目拟在此基础上，筛选EdHP1的互作蛋白，通过体内、体外蛋白互作验证实验，相应互作蛋白拟南芥突变体的表型鉴定，突变体杂交实验，明确互作蛋白与EdHP1之间相互关系，阐明EdHP1在蛋白水平的调控机制；进一步将EdHP1基因转化小麦，结合室内及田间低钾、重金属耐性实验，比较转EdHP1基因小麦与受体在不同发育时期、不同部位K+和重金属离子积累量的差异，各种离子转运体活性的变化，阐明EdHP1基因的生理作用机制；通过田间产量鉴定试验评估该基因的育种价值。

提高养分利用效率是提高粮食产量的重要途径。氢离子焦磷酸化酶（H+-pyrophosphatase，H+-PPase）利用水解焦磷酸（PPi）产生的能量将质子（H+）从膜的一端运输到另一端，在膜内外形成质子梯度，这种质子梯度对于蔗糖和有机酸的储藏，细胞渗透压的维持，细胞质的去毒作用均有重要的意义。现有的研究证明，过表达H+-PPase基因可以显著提高植物对各种非生物胁迫的抗性，具有重要的应用价值。本项目前期工作从抗逆性强的小麦野生近缘植物披碱草中克隆了一个氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1，基因功能研究证明其不仅可以提高植物对干旱、高盐、低温等非生物胁迫的抗性，而且首次发现其可以同时提高植物耐低钾、耐重金属铅胁迫的能力，具有重要的应用价值。目前，对于H+-PPase类基因的研究主要集中于基因功能及生理机制的研究方面，其调控途径仍然未知。本研究针对EdHP1基因的调控机制开展研究，同时评价其在小麦抗逆遗传改良研究中的应用价值。首先，以EdHP1拟南芥同源基因AVP1为诱饵，采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选与AVP1互作的蛋白，经筛选获得非重复的克隆150个，经过酵母互作实验、BiFC实验进一步确定了4个重点研究的互作蛋白，其中包括2个蛋白激酶基因（AZK和RLK），1个小G蛋白基因（RAB）和1个ATPase酶C亚基基因，以及14个具有研究价值的互作蛋白。通过对AVP1、AZK、RLK和RAB等4个基因突变体的表型进行分析发现AVP1突变体在高盐、低钾和低磷胁迫条件下的表型分别与AZK、RLK和RAB 3个突变体的表型一致，初步证明AZK、RLK和RAB作为上游基因参与在逆境胁迫条件下对AVP1的调控，这一发现与现有文献比较首次发现了AVP1在蛋白水平的调控机制。同时，获得稳定的转EdHP1基因小麦株系，通过连续2次的田间营养吸收实验证明，转EdHP1基因小麦在低钾或者低磷等胁迫条件下产量比受体明显提高，从产量三要素方面分析产量的提高主要与穗粒数的提高相关。同时，转基因小麦的秸秆和籽粒中磷、钾的含量也显著提高，证明EdHP1基因可以提高转基因小麦对钾、磷等元素的吸收，证明EdHP1基因在小麦抗逆遗传育种具有重要的利用价值。另外，本研究除了发表2篇文章外，部分研究结果正在整理，有望发表高水平的SCI文章。