高效抗NSCLC的FIP筛选及其在EGFR上结合位点的确定与验证

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the most malignant tumor with the highest morbidity and mortality, and it is difficult to detect early. Epidermal growth factor receptor (EGFR) gene is one of the most common driving genes in NSCLC. Although the therapeutic effect of developed specific targeted drug for EGFR is significant, causes secondary mutation of EGFR to cause drug resistance. Recent studies have found that the fungal immunomodulatory protein (FIP) not only directly inhibits the cell proliferation of NSCLC, but also increases the anticancer activity of EGFR inhibitors and prevents NSCLC from becoming resistant to its inhibitors. The binding site of FIP on EGFR does not coincide with the developed EGFR monoclonal antibody inhibitor binding site, which is a new target and a target for sensitizing EGFR inhibitors. However, the binding site of FIP on EGFR is not clear. This project will screen more efficient FIP that inhibits EGFR expression and promotes EGFR degradation activity based on the pre-explored FIP. And the combination of theoretical calculations and experiments will be used to determine and validate the binding site of FIP on EGFR. In order to develop a more active FIP and a novel anti-NSCLC targeted drug, it provides a reliable theoretical basis for improving the drug resistance of NSCLC cells.

非小细胞肺癌NSCLC是发病和死亡率最高的恶性肿瘤，且早期很难发觉。表皮生长因子受体EGFR基因是NSCLC中最常见的驱动基因之一，已开发的EGFR特异性靶向药物，虽然治疗效果显著，但会引起EGFR二次突变而产生耐药。近期研究发现，真菌免疫调节蛋白FIP不仅可以直接抑制NSCLC的细胞增殖，还可以提高EGFR抑制剂的抗癌活性，并阻止NSCLC对其抑制剂产生耐药。FIP在EGFR上的结合位点与已开发的EGFR单抗抑制剂结合位点不重合，是一个新的作用靶点，也是使EGFR抑制剂增敏的靶点。然而，FIP在EGFR上的结合位点尚不明确。本项目将在前期挖掘的FIP基础上，筛选抑制EGFR表达和促进EGFR降解活性更高的FIP，并设计理论计算与实验相结合的研究方案，确定并验证FIP在EGFR上的结合位点，为开发具有更高活性的FIP和新型抗NSCLC靶向药物，改善NSCLC细胞耐药现状提供可靠的理论基础。

EGFR是治疗NSCLC的重要靶标蛋白，已开发的针对EGFR特异性靶向药物，虽然治疗效果显著，但会引起EGFR二次突变，从而产生耐药性。FIP是从药用担子菌中发现的结构和功能与免疫球蛋白重链可变区相似的一类小分子蛋白质。研究发现，FIP可以在不影响EGFR和配体EGF相结合的情况下，促进EGFR的泛素化降解，增加EGFR靶向药物的敏感性，降低EGFR继发突变产生耐药的可能性。因此，FIP是毒副作用小且抗癌活性独特的一种治疗NSCLC的候选药用蛋白，FIP在EGFR上的结合位点也是一个新的成药靶点和使EGFR抑制剂增敏新靶点。然而FIP在EGFR上的结合位点尚不清楚。本项目发现除了灵芝，在草菇和毒蝇鹅膏等大型真菌中也有FIP的存在，通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和阻止肿瘤细胞迁移以及抑制肝坏死等抗肿瘤和免疫调节实验，筛选出抗肿瘤和免疫调节活性高的FIP，作为进一步开发的候选小分子蛋白质。同时，经过多轮的分子建模，蛋白对接，分子动力学模拟以及自由能的计算，模建FIP单体和同源二聚体的三维结构，比较FIP单体之间的结合自由能以及同源二聚体的稳定性。预测FIP同源二聚体与 EGFR 胞外结构域的结合位点，并构建FIP与EGFR的复合体三维结构。利用分子动力学模拟和MM-GBSA结合自由能计算，比较抗肿瘤活性高和低的FIP与EGFR形成复合体的稳定性，发现FIP通过与EGFR单体竞争结合位点从而抑制EGFR信号通路的激活，其中FIP的B链GLY104，A链GLN106，LYS111，LYS113，GLN26等氨基酸残基是与EGFR上ASP147，TYR251，ASP279，LYS303和LYS304等结合的关键氨基酸残基。本项目为开发具有更高活性的FIP和新型抗NSCLC靶向药物，改善NSCLC细胞耐药现状提供可靠的理论基础。