虫草多糖活性片段的筛选及分子作用机制的研究

It was the first time we found one polysaccharide from Cordyceps Sinensis mycelium. It can treat chronic renal failure through TGF-β1 pathway. We'll get the basic active fragments from Cordyceps Sinensis polysaccharide (CPS) by chemical or biological methods, then find the best fragment through TGF-β1 induced cell model. The influence of CPS active fragments to the key factors in TGF-β1 induced epithelial-mesenchymal transition, such as SMAD family, will be revealed dynamically on the molecular level. The celluar signal pathway and the target of CPS active fragments will be found. TGF-β receptor Ⅱ knockout mice will be used to validate the effect in vivo. As most of the polysaccharides have the bi-directional immunomodulatory activities, CPS active fragments will be supposed to have bi-directional regulation on TGF-β1 protein. We'll use HK-2 cells to reveal the mechanism differences between CPS active fragments and other micromolecular TGF-β1 inhibitors. In a word, this project will be focused on the research of CPS active fragments to reveal the special bi-directional regulation. The project will break through the used research on the chronic renal failure therapeutical effect of Cordyceps and make some contribution to the moderniaztion of traditional Chinese medicine.

申请人首次发现来自虫草菌丝体的虫草多糖治疗慢性肾功能衰竭，是通过抑制TGF-β1而发挥效应的。为探明虫草多糖中最基本的活性片段，拟采用化学、生物等手段降解获取虫草多糖若干片段，在TGF-β1诱导的细胞模型中进行筛选，寻找最佳活性片段。进而从分子水平多维动态地揭示虫草多糖活性片段在TGF-β1诱导的上皮-间质转化过程中，对以SMAD家族蛋白为代表的关键因子的影响，寻找虫草多糖活性片段在细胞内的信号通路及其作用靶点。最终运用TGFβRⅡ基因敲除小鼠模型进行体内靶点验证。受多糖具有双向免疫效应启发，假说虫草多糖活性片段对TGF-β1表达水平有双向调控效应，在HK-2细胞模型下，与小分子TGF-β1抑制剂比较，揭示两者作用机制的本质差异。通过本课题对虫草多糖活性片段的研究，初步揭示多糖特有的双向作用机制，对冬虫夏草治疗慢性肾病药效物质基础研究有所突破，为中药现代化的发展作出贡献。

本实验室分离提取得到的虫草多糖，前期研究已完成其提取纯化、结构分析、质量标准的制订、药理毒理等相关临床前全部研究资料，并已获得新药临床研究批件。临床前药效学研究结果显示本虫草多糖对多种原因引起的慢性肾衰竭均有较好的治疗作用。为了进一步阐明虫草多糖缓解慢性肾功能衰竭的机理，在前期研究的基础上，本课题模拟体内环境将虫草多糖经人工胃液水解后的活性片段作用于血小板源性生长因子诱导的人肾小球系膜细胞HMC损伤模型，验证其对肾小球系膜细胞的作用，从RNA和蛋白质水平多维动态地检测信号通路中的关键分子表达变化，以及采用瞬时转染的方法，找出CPS-F缓解慢性肾衰的信号通路以及作用靶点。.方法：研究采用血小板源性生长因子PDGF-BB刺激HMC产生病变模型，运用MTT方法检测不同浓度PDGF-BB，CPS-F，作用24h后对细胞过度增殖的作用。Western Blot和RT-PCR法分别在蛋白质、RNA水平上检测CPS-F对PDGF-BB诱导细胞炎症反应的标志物 TNF-α，MCP-1，ROS，以及PDGFR-β，TNFRⅠ，TNFRⅡ的变化，对ERK/Akt中关键因子的影响。PDGFR-β拟作为CPS-F发挥效应的关键靶点，实验采用荧光素酶启动子构建PDGFR-β启动子载体，转染HMC，检测CPS-F对PDGF-BB诱导其启动子的调控。另外，我们通过设计干扰RNA沉默PDGFR-β和和NOX1，采用western blot和RT-PCR法分别在蛋白质、RNA水平上检测CPS-F对PDGF-BB诱导的PDGFR-β，TNF-α，TNFR I以及MCP-1的表达量变化。.结果：各浓度CPS-F均有抑制由PDGF-BB诱导的HMC细胞炎症的作用，且呈剂量依赖性。CPS-F作为多靶点药物，不仅是TNF-α抑制剂，还可以抑制PDGFR-β受体在细胞膜上过度表达，且通过ROS以及ERK/Akt信号通路维持细胞正常状态。通过构建启动子荧光素酶实验进一步确定CPS-F通过干预PDGFR-β受体启动子活性发挥缓解肾损伤的作用。沉默PDGFR-β，CPS-F对TNF-α具有调回正常水平的作用。这表明多糖具有双向调节作用，和普通小分子TNF-α抑制剂不同，在表达量高于正常水平时，CPS-F可下调其表达量，而低于正常水平时可上调至正常值，维持细胞因子正常水平，纠正紊乱，保护肾脏功能。