以EGFR为识别靶位多靶点联合克服NSCLC EGFR TKIs耐药的基因干预研究

EGFR TKIs（激酶抑制剂）对NSCLC EGFR阳性患者疗效显著，但EGFR T790M突变、MET基因扩增和EGFR/HER2双阳性表达却导致耐药。尽管目前可采用二代不可逆EGFR/HER2 TKIs、联用MET抑制剂等策略，但仍存在疗效不佳、副作用大和耐药等问题。文献和我们的研究表明，多靶点联合抑制癌基因是克服上述难题的策略。我们前期已成功建立了一种单链抗体介导靶向siRNA的治疗新策略，并且筛选出了高效抑制HER2 siRNA。本项目拟在此基础上，设计联合针对EGFR、HER2和MET 的siRNA，进一步构建为EFGR 单链抗体-鱼精蛋白（ScFv-tP）/siRNA复合物(EFGR ScFv-tP/siRNA)，利用靶向载体的特异识别、内化功能，将多靶点siRNA导入肺癌细胞以及荷瘤鼠体内，观察其协同抑制肿瘤生长、逆转耐药效果，为克服肺癌EGFR TKIs耐药提供新策略。

非小细胞肺癌（NSCLC）患者靶向治疗的耐药，尽管采取多种有效措施，仍然不可避免耐药，导致病情恶化，克服耐药依然是该领域研究的热点和难点。本研究目的：构建EGFR单链抗体，建立EGFR单链抗体介导的药物靶向输送系统，实现动物体内多靶点高效低毒的靶向药物治疗，逆转TKI耐药。内容：EGFR特异性单链抗体（scFV，s-9R）重组基因的构建、表达与活性检测；siRNA设计、合成、筛选及联合应用效果的研究，体外检测scFV、s-9R携带特异性siRNA对肺癌细胞目的基因表达水平的影响及药物敏感性变化；s-9R介导靶向siRNA体系的体内示踪、效应及其机理的研究；临床NSCLC标本EGFR、HER2及CXCR4检测。结果： 基因工程制备的scFv及s-9R具良好的EGFR结合活性和内化活性；s-9R可携带核酸siRNA活性并下调靶基因表达；s-9R/siRNA联合Gefitinib后EGFR TKI耐药NSCLC细胞凋亡增加；s-9R/HER2-siRNA使NSCLC细胞增殖、克隆形成能力降低，细胞周期停滞；小动物活体成像显示scFv及s-9R能富集于荷瘤部位，s-9R可使siRNA富集于荷瘤部位；s-9R/EGFR-siRNA联合Gefitinib，或s-9R/HER2-siRNA混合物作用于荷NSCLC移殖瘤裸鼠，裸鼠移殖瘤成瘤率下降，瘤体积变小、重量减轻，裸鼠生存时间延长，移殖瘤切片显示肿瘤细胞靶蛋白表达减少，细胞增殖能力下降，凋亡增多，结论：成功构建了高效表达EGFR单链抗体融合蛋白的基因工程体系；建立了动物体内单链抗体介导的特异性EGFR分子靶向输送系统，EGFR单链抗体携带靶分子siRNA成功逆转肺癌细胞EGFR-TKI耐药，实现动物体内高效低毒基因治疗目的，为克服EGFR TKI耐药提供了一条新思路。