水环境-生物体共享抗性基因迁移转化规律及分子机制

Antimicrobial resistance (AMR) is one of the most serious global challenges, and it is exacerbated by dissemination of antibiotic resistance genes(ARGs) between microbiology communities. A complete and independent village in Zhejiang province is selected as the study area to explicit the spatial and temporal distribution of ARGs and antibiotic resistance bacteria (ARB) and to reveal the characteristics of shared resistance genes and mobile gene elements (MGEs) from natural water environment (including surface water, underground water), man-made water environment (including sewage treatment systems, drinking water treatment systems) and organism (including fish, human body) using modern analytical technology means, such as high-throughput real-time PCR, 16S rDNA sequencing and metagenome sequencing. The conjugational transfer and transformation experiments will be set up to define the dissemination and molecular mechanism of the shared resistance genes in the environment. The behavior characteristics of shared resistance genes in water environment and organism will be described via the studies of dissemination mediated by organism. This research can help to evaluate the fate and risk of ARGs in water environment scientifically and try to provide a theoretical basis of effective control method.

近年来微生物耐药问题日趋严重，环境中抗性基因以惊人的速度在细菌之间传播，大大加剧了耐药细菌的风险。本项目选取浙江省某完整且独立的村镇，采用高通量荧光定量PCR、16S rDNA高通量测序和宏基因组测序等现代分析手段，在表征研究区域内自然水环境(地表水和地下水)、人为水环境(污水处理系统和饮用水处理系统)和生物体(鱼类和人体)抗性基因、抗性细菌时空分布基础上，揭示水环境-生物体共享抗性基因及可移动基因元件的分布特征；通过共享抗性基因的接合转移和转化转移实验，明确共享抗性基因在环境中的传播规律及分子机制；结合生物体介导下的共享抗性基因传播规律，明确共享抗性基因的可移动性和生物可获得性。本项目的研究有助于科学地评估环境中抗性基因的行为特征及健康风险，为揭示抗性基因的传播规律及有效的控制提供科学依据。

本研究表征了多种水环境及生物体中抗生素抗性基因的时空分布，揭示了水环境-生物体共享抗性基因及可移动元件的分布特征；通过耐药菌株分离及水平传播实验，明确了典型耐药质粒的传播规律、遗传特征及抗性基因介导耐药的分子机制；建立生物体暴露模型，探究共享抗性基因的可移动性和生物可获得性，明确环境中颗粒物对耐药细菌在生物体内定植的影响及机制；基于当前控制措施难以有效去除抗性基因的现状，探究了电化学、超滤等控制方法阻控抗性基因迁移传播的可行性。结果显示，污水处理系统出水中有大量ARGs残留，其中有35种ARGs在所有样品中共享，它们可能有更高的水环境-生物体传播风险；人体密切接触水环境与人体共享的ARGs中包括aadA、aac(3)、blaGES等抗性基因，它们可能造成人体ARGs的潜在暴露；水产养殖环境中blaOXY、aadA7等7种ARGs被认为是养殖水环境-鱼类共享ARGs；在野生鱼及其栖息水环境中， mcr-1等10个ARGs被鉴定为水环境-野生鱼共享ARGs，野生鱼类被证明是ARGs的重要携带者和传播者；流域水环境中，53种ARGs被鉴定为水环境-人体共享ARGs，且与特定微生物有很强的共出现模式，暗示共享ARGs可能以特征微生物为媒介在水环境-人体间迁移传播；从流域水环境中分离6个携带mcr-1的质粒，其转移效率介于10^-4~10^-6，它们与猪源、人源大肠杆菌密切相关，支持了mcr-1在水环境-生物体之间传播的概念；在医院水环境中发现blaNDM、mcr-1、tet(X4)等基因可以共存于同一菌株，其转移效率可达10^-6~10^-5；体外(蛋白)反应结合质谱分析表明，NDM和Tet(X4)通过降解抗生素产生耐药，而MCR通过改变细菌脂质A的结构降低与多粘菌素的亲和性产生耐药；ARGs传播实验表明，颗粒物可以显著促进ARGs的水平转移，ROS和SOS的增加，细胞膜通透性的提高，接合转移相关基因的上调起到了关键作用；基于动物暴露模型，细颗粒物可以损伤小鼠组织细胞，致使免疫系统削弱从而提高耐药细菌的定植率，最高可达7.4倍；延伸研究表明电化学处理对共享抗性基因mcr-1有很好的去除效果，超滤与传统消毒相比，其不会导致胞外ARGs释放及VBNC状态细菌的问题。本项目揭示了水环境及生物体中抗性基因的行为及共享特征，为揭示抗性基因的迁移转化规律以及进行有效阻控提供了科学依据。