草莓匍匐茎基因 RL1 的图位克隆及功能分析

Strawberry runner is one of the most important agronomic characters in strawberry production, the number of runners direct influence the yield, quality and generation of strawberry, so there is no doubt that it has very important research value to clone runner-controlled gene(s). So far, there were still no research reports on the cloning and functional analysis of genes which control the formation of runners. In our previous studies, we have demonstrated that runnering- phenotype is dominant pattern of inheritance through artificial hybridization method, we also have obtained F2 segregation population, next we will identify Runnering locus 1 (RL1) by map-based cloning. Then, we will use GUS histochemical staining, subcellular localization and tissue expression pattern to preliminary analyze the function of the gene(s). In addition, in order to illuminate the relationship between RL1 gene and hormone(s) in runner formation, the expression level of hormone-related genes will be analyzed and runnering phenotype will be observed after hormone treatments in transgenic plants. This study is significant for fully exploring the regulatory mechanisms of runner formation in strawberry, it can also provide technical support for molecular breeding of strawberry in the future.

匍匐茎是草莓最重要的农艺性状之一，其数量直接决定草莓的繁殖和最终果实的产量与品质，因此，草莓匍匐茎基因具有非常重要的研究价值。迄今为止，控制草莓匍匐茎的基因仍未被克隆，匍匐茎发生的分子机制也没有深入的报道。在前期的研究中，我们已通过杂交的方式证明了草莓匍匐茎是一个显性遗传的性状，并获得了Ruegen/Hawaii 4 的F2分离群体。本研究拟采用图位克隆的方法克隆控制草莓匍匐茎的基因Runnering locus 1 (RL1)，并通过GUS 染色、亚细胞定位、组织表达分析等实验初步分析该基因的功能。另外，通过激素调控途径相关基因的表达分析和外源激素处理等方式，探索 RL1 基因和某一种（或几种）植物激素在草莓匍匐茎发生过程中的相互调控作用。本研究将为进一步全面解析RL1调控草莓匍匐茎发生的分子机制奠定理论基础，还为草莓的分子标记辅助选择育种提供技术支持。

匍匐茎是草莓最重要的农艺性状之一，其数量直接决定草莓的繁殖和果实的产量，因此，草莓匍匐茎基因具有非常重要的研究价值。本项目拟对草莓匍匐茎基因进行图位克隆，并对匍匐茎发生的分子机制进行初步探索。研究结果显示森林草莓中无匍匐茎Ruegen和有匍匐茎的Hawaii4的杂交F1代具有匍匐茎，证明草莓匍匐茎是一个显性遗传的性状。Ruegen/Hawaii4的F2群体中有匍匐茎：无匍匐茎的表型分离比为3:1，表明Hawaii4中控制匍匐茎的基因相对于Ruegen是由单显性基因控制的。我们利用F2分离群体中无匍匐茎的极端隐性单株，最终将Hawaii4中控制草莓匍匐茎的基因Runnering locus 1 (RL1)定位在第二条染色体两个SSR标记SSR41和SSR46之间约420kb的物理距离。同时，我们对草莓匍匐茎的发生过程进行了观察记录，通过施用外源赤霉素可使无匍匐茎的亲本Ruegen产生匍匐茎，表明Ruegen中无匍匐茎的表型可能是由于赤霉素合成途径受到影响导致的，这为筛选候选基因提供了依据。.我们定位的区间包含一个GA20ox4基因，对亲本和F2群体中极端隐性单株的GA20ox4基因测序结果发现无匍匐茎的草莓是由于GA20ox4基因发生突变导致的，这与2017年发表在Plant Cell上的论文的研究结果一致。表明本项目拟克隆的草莓匍匐茎基因RL1就是赤霉素合成基因GA20ox4。为了避免资源浪费与重复工作，我们及时对实验方案进行了调整。.我们构建了草莓匍匐茎组织的酵母cDNA文库，通过酵母单杂交实验成功获得与GA20ox4基因启动子的互作蛋白bHLH16，并通过双荧光素酶实验进行了验证。表达分析结果表明GA20ox4和bHLH16在匍匐茎组织高表达，亚细胞定位将bHLH16定位于细胞核中，目前正在进一步的进行转基因验证。.另外，我们对另一个控制匍匐茎的基因所在的家族进行了鉴定和分析，从森林草莓中共鉴定到54个GRAS家族基因。该家族基因在不同的组织表达量不尽相同，例如有34个FveGRAS基因至少在4个组织/器官中表达，少数FveGRAS基因具有组织特异性表达。特别是我们鉴定出了几个在草莓匍匐茎表达量较高的GRAS基因，如FveGRAS3, FveGRAS35和FveGRAS52，为FveGRAS基因家族的研究奠定了基础，并为后续筛选重要功能基因指明方向。