蛋白质-聚合物偶联物的可控制备及其对蛋白质性能的影响

Conjugation of synthetic polymers to proteins has proven to be a viable means of overcoming the immunogenicity and short in vivo circulation time limitation of proteins, which effectively enhances the activity and stability of protein drugs. Placement of the stimuli-responsive polymer chain near the protein active site makes it possible for biomolecular activity switching. However, control of protein activity is very difficult. The structure of polymers and coupling position and method are the major influence factors. Therefore, research on the precise control of structure of protein polymer conjugates and the relationship between structure and activity of protein is an important topic at the forefront of the biomacromolecular field. This project aims at exploring the basic relationship between structure of protein-polymer conjugates and activity of protein by combining advanced biological techniques (molecular cloning, gene mutation, etc.) and rapid and well-controlled visible light radiation aqueous reversible addition-fragmentation chain transfer radical polymerization (RAFT). We choose pyrophosphatase enzyme (PPase) as model protein and conjugate it with different types of polymer with various precisely controlled chain length at designed sites of the model protein, in order to explore the effect of polymer type, chain length and conjugation site on protein activity and stability. The outcome of this project is expected to provide experimental evidence and theoretical guidance for the preparation of high efficiency protein drugs and protein complexes with controlled activity.

将生物相容的合成聚合物通过合适的方式与蛋白质偶联，不仅能够解决蛋白质的免疫原性和循环时间短等缺陷，还能有效提高蛋白质药物的活性及稳定性。如果利用刺激敏感型聚合物还可能实现蛋白质活性"开-关"的控制。但是，聚合物的结构以及在蛋白质上的引入方法、位置都直接影响到蛋白质活性的控制。因此，如何精确控制聚合物-蛋白质偶联物的结构并研究结构与其活性之间的关系是生物大分子领域的前沿课题。在本项目中我们提出以焦磷酸水解酶（PPase）为模型蛋白质，利用分子克隆、基因突变等技术表达系列突变位点不同的模型蛋白质，通过可见光活化的快速可控水相RAFT方法制备系列精确结构的偶联物，研究聚合物种类、链长及引入位点对蛋白质活性及稳定性的影响，探索偶联物的结构与蛋白质性质之间的关系，为制备高效蛋白质药物和活性可调的蛋白质偶联物提供实验依据和理论指导。

本项目按计划成功完成了“蛋白质-聚合物偶联物的可控制备及其对蛋白质性能的影响”的研究目标。在蛋白质-聚合物偶联物的结构设计和功能调控方面开展了系统的研究工作， 具体如下：1）制备了一系列不同位点处含有巯基的模型蛋白质，利用基因定点突变的方法在大肠杆菌无机焦磷酸水解酶（PPase）表面特定位点处引入半胱氨酸残基，进而利用半胱氨酸侧链的巯基进行聚合物的偶联；系统研究了pH响应性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）结合位点及分子量对蛋白质活性和稳定性的调控作用，提供了一种维持蛋白质酸性环境活性和稳定性的改性策略。2）分别通过Grafting to和Grafting from的方法在PPase表面引入温度响应性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm），并考察了聚合物引入方式对蛋白质活性和稳定性的影响，为探索利用聚合物修饰蛋白质并提高其耐高温能力提供了可行的策略。3）研究了不同结构糖聚物与蛋白质的偶联及其对蛋白质生物学活性的调节作用，考察了线性糖聚物与星形糖聚物在蛋白质结合能力上的差异及糖聚物改性蛋白质的潜在应用。4）探讨了生物亲和作用和主客体相互作用等非共价相互作用在蛋白质-聚合物偶联物制备中的应用及其对蛋白质活性的调控作用，对设计制备性能优异的蛋白质-聚合物偶联物及发展蛋白类药物具有一定的指导意义。通过以上工作系统研究了聚合物不同结合位点、不同种类及链长聚合物的引入以及不同引入方式对蛋白质生物学活性的影响，揭示了蛋白质与聚合物偶联时的相互作用规律，为性能可控蛋白质-聚合物偶联物的设计和合成提供了可靠的实验依据和理论指导。