Ag85a/IL-17重组耻垢分枝杆菌诱导抗IL-17自身抗体抑制哮喘气道炎症机制研究

IL-17对哮喘气道炎症具有双重调节作用，其介导的中性粒细胞浸润是激素抵抗型哮喘气道炎症损伤的重要机制。前期研究我们用耻垢分枝杆菌表达了具有生物活性的mIL-17，发现该重组疫苗可以抑制特应性哮喘小鼠气道炎症损伤，同时可增强其抗感染的能力。而将IL-17片段与Ag85a嵌合表达时，嵌合蛋白不具IL-17生物活性，但获得的Ag85a/IL-17重组耻垢分枝杆菌疫苗可诱导产生抗IL-17自身抗体。本项目拟在此基础上，进一步对疫苗从诱导抗体水平及安全性进行优化筛选。并以RAW264.7细胞、OVA过敏性哮喘和DO11.10非特应性哮喘小鼠模型为研究对象，利用疫苗诱导抗IL-17自身抗体的特性，研究对T细胞分化，趋化因子表达、炎症因子表达、气道高反应、气道修复重建的影响，探讨该重组疫苗诱导抗IL-17自身抗体抑制哮喘气道炎症的机制，从诱导细胞因子自身抗体的角度，为哮喘治疗性疫苗研究提供实验基础。

支气管哮喘是目前最为关注的公共健康问题，影响全球数百万患者的健康。IL-17A被证实是哮喘发生发展的关键因子。阻断内源性IL-17A的致炎作用有望成为哮喘治疗的新靶点。以耻垢分枝杆菌作为载体菌，利用外源蛋白为IL-17A提供Th 细胞抗原结合表位，构建诱导抗IL-17A自身抗体疫苗用于防治哮喘，既有可能性又有必要性。.本研究拟构建重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a，并利用rMS-Ag85a-IL-17a疫苗诱导抗IL-17身抗体的特性，将疫苗接种过敏性哮喘小鼠模型，探讨该疫苗抑制哮喘气道炎症的可能性及机制。.本课题成功构建pET-28a-Ag85a-IL-17a原核表达质粒，利用原核表达、蛋白纯化技术制备了重组蛋白Ag85A-IL-17A。通过构建哮喘小鼠模型发现，重组蛋白Ag85A-IL-17A显著降低了哮喘小鼠BALF中Th17型细胞因子以及Th2型细胞因子水平；降低免疫小鼠小气道周围的炎症以及BALF中总细胞数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的数量；降低了体外培养的脾细胞IL-13+T细胞的数量；肺组织CXCL1和CCL2 mRNA的水平在重组蛋白Ag85A-IL-17A免疫组明显降低。证实重组蛋白Ag85A-IL-17A具有拮抗哮喘小鼠气道炎症的作用。.本课题以大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMFA42S为载体，在前期实验基础上，构建重组穿梭表达质粒pMFA42S-Ag85a-IL-17a，采用电转化技术构建表达融合蛋白Ag85A-IL-17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗rMS-Ag85a-IL-17a，其经鼻腔黏膜免疫干预过敏性哮喘小鼠。实验结果提示，rMS-Ag85a-IL-17a可在体内诱导产生抗IL-17A自身抗体，降低IL-17A以及IL-6的表达水平，同时调节Th1/Th2免疫平衡，下调Eotaxin-1、 MIP-2等趋化因子的表达，从而有效抑制哮喘小鼠气道炎性细胞浸润和黏液分泌，减轻气道炎症反应。.本研究成功构建了能够体内诱导产生自身抗体的重组疫苗，证实了通过外源性蛋白提供Th细胞抗原表位，可诱导产生针对自身蛋白的抗体。构建的重组疫苗同时兼具有调节Th1/Th2免疫失衡及抑制IL-17A的功能，对嗜酸性粒细胞和中性粒细胞气道炎症均有抑制作用，为未来抗气道炎症的研究提供了一个新方向。