结核分枝杆菌的模式菌株耻垢分枝杆菌新型硝酸还原酶的鉴定

Nitrate metabolism is critically involved in the establishment of Mycobacterium tuberculosis persistent infection. As the model organism for M. tuberculosis, although both respiratory and assimilatory nitrate reductase activities are recognized in Mycobacterium smegmatis, their encoding genes have not been thoroughly characterized and reported so far. Our preliminary experimental analyses revealed a novel nasA gene, which is likely to encode an assimilatory nitrate reductase, suggesting that major differences in nitrate metabolism between M. tuberculosis and M. smegmatis. In this study, we intend to confirm and further characterize the novel nitrate reductase NasA of M. smegmatis via in vitro enzymology assays and in vivo genetic analysis. Based on the comparative study of different types of bacterial nitrate reductases with respect to their structural and functional relationships, phylogenetic study of Mycobacterium focusing on the divergent evolution of nitrate metabolism mechanisms represented by M. smegmatis versus M. tuberculosis may facilitate our understanding about the evolving process of the pathogens from their non-pathogenic ancestors.

硝酸盐代谢与结核分枝杆菌持续性感染的建立密切相关。耻垢分枝杆菌作为研究结核分枝杆菌的重要模式菌株，已有研究表明，其具有硝酸盐呼吸和同化的功能，但其相关功能基因迄今未见确切报道。我们前期的遗传学研究在耻垢分枝杆菌中，发现一个在结核分枝杆菌中不存在的潜在的同化型硝酸还原酶基因nasA。本课题计划通过一系列生化及遗传实验，确证该NasA的同化型硝酸还原酶功能，并鉴定其酶学催化机理；在与各种细菌硝酸还原酶结构特征与功能特征比较的基础上，加强与结核分枝杆菌硝酸盐同化机制的种系发生比较，为探索分枝杆菌从环境自养向动物宿主寄生生长模式进化机制的研究奠定基础。

硝酸盐是微生物的主要无机氮源之一。许多细菌和古细菌都具有表达同化型硝酸还原酶（NAS）的能力，该酶可催化硝酸盐向亚硝酸盐的限速还原。尽管已经提出了分枝杆菌中的硝酸盐同化途径，并在生理和遗传上得到了验证，但相应的NAS酶尚未确定。本项目对耻垢分枝杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）的硝酸盐同化途径进行了深入的探索和研究。本项目发现并鉴定了由耻垢分枝杆菌Msmeg_4206编码的一种新型NAS酶，命名为NasN。与经典的NAS酶相比，NasN在结构、电子传递机制、酶学性质以及系统发育分布等方面具有明显不同的特点。通过序列分析和生化表征，本项目发现NasN是NADPH依赖的，含双黄素的单体酶，由典型的结合钼蝶呤辅因子的催化结构域和结合FMN-FAD/NAD的电子接收/转移结构域组成，使其异于所有先前报道的异源寡聚NAS。遗传研究表明，NasN对耻垢分枝杆菌在以硝酸盐作为唯一的氮源的有氧生长必不可少，并且全局性转录调节因子GlnR调节nasN的表达。此外，与NADH依赖的异源二聚NAS酶不同，NasN可以有效地支持细菌在硝酸盐限制条件下的生长，这可能是由于其具有更高的催化活性和耐氧性。系统发育分析的结果表明，nasN基因比编码其他NAS的基因更晚进化，其分布主要限于放线菌和变形杆菌。本项目发现，在分枝杆菌中，大多数快速生长的环境分枝杆菌携带nasN，但由于分枝杆菌进化过程中存在多个独立的基因组缺失事件，因此该基因在慢速生长的致病性分枝杆菌中大量缺乏。这为探索分枝杆菌从环境自养向动物宿主寄生生长模式进化机制的研究奠定了基础。