纳豆芽孢杆菌gudB1-GDH对低氨发酵的分子调控机理

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)由rocG和gudB1基因编码，是连接碳氮代谢的关键酶，对该菌的生长和产氨都有明显的影响。本课题拟通过基因敲除、定点突变和同源重组，获得rocG和gudB1双缺失及rocG缺失、gudB1定点突变的系列菌株。以野生型和双缺失型菌株为对象，利用13C标记葡萄糖，结合GC-MS检测技术和FiatFlux软件分析技术，对胞内的代谢流量进行分析，结合胞外代谢物含量的检测结果，构建并优化GDH缺失菌株的碳氮中心代谢网络模型。分析具有不同gudB1-GDH酶活的系列突变株的生物量、产氨量、代谢流量分布等数据，构建描述碳/氮源、代谢流量、产氨量与菌体生长间关系的数学模型。同时比较分析不同菌株间关键酶活性、关键酶基因和主要代谢调控基因转录水平的差异，揭示gudB1-GDH在碳氮中心代谢中代谢调控机理，为低产氨纳豆芽孢杆菌的选育提供思路。

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)和脲酶对纳豆发酵过程中产氨有显著影响。GDH是连接碳氮代谢的关键酶，对该菌的生长也非常重要。本课题首先对枯草芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)和脲酶对纳豆发酵过程中产氨有显著影响，其中GDH是连接碳氮代谢的关键酶，对该菌的生长也非常重要。本课题首先对枯草芽孢杆菌GDH及脲酶编码基因的序列和非编码区各元件进行了分析，同时对纳豆菌的脲酶性质进行了研究，结果表明两基因在进化中相对比较保守、转录效率较高，脲酶的最佳产酶条件和纳豆菌的最佳生长条件高度一致，因此，基因水平的改造才是降低产氨量的有效途径。.对gud B基因进行定点突变，成功获得7个酶活下降的突变体，分别为活性位点K80、K116和S351的单、双和三位点突变体。成功构建了rocG插入失活突变株BS 168::△rocG和脲酶失活突变株BS 168::△ure突变株，实验结果表明编码GDH的rocG和gudB可以互补，但BS 168::△ure的脲酶完全失活且不影响菌的生长。本研究证实通过ure基因敲除、GDH定点突变和同源重组可获得低产氨纳豆发酵菌株，为进一步研究GDH和脲酶影响产氨和生长代谢的机理奠定了坚实的基础。