HLA转基因小鼠的优化及其在乙肝病毒HLA-A11限制性CTL表位筛选中的应用

Approximately 5% of the world's human population is infected with hepatitis B virus (HBV) and, despite the availability of an effective vaccine, the number of chronic HBV carriers continues to increase. Viral persistence occurs in the majority of persons infected early in life and develops in 5-10% of persons infected during adulthood. Although the cell-mediated immune responses involved in liver damage and viral clearance during HBV infection in human still remain largely unknown, it is generally accepted that cytotoxic T lymphocyte (CTL) response to HBV plays an essential role in viral clearance and clinical recovery during hepatitis. In this study, we will generate a novel transgenic (Tg) mouse (named RP11-10A19 BAC Tg mouse) carrying human TAP1, TAP2, PSMB8, PSMB9 molecules, which are all involved in MHC class I antigen presentation pathway. This new Tg mouse will have potencial to improve the epitope presentation efficiency of HLA Tg mouse. Subsequently, We will cross the RP11-10A19 BAC Tg mouse to HLA-A11/HBV dual transgenic mouse to breed a triple Tg mouse. Using the triple Tg mouse, we will try to identify new HBV CTL epitope peptides, which could induce strong CTL immune responses. The results might have an important therapeutic application in HBV infection.

由乙肝病毒（HBV）感染引起的慢性乙肝是我国当前流行最广泛、危害最严重的一种传染病，是肝癌发生的重要危险因素，严重影响人民健康。慢性HBV感染的主要问题是涉及免疫反应各个阶段的抗病毒反应的缺陷，尤其是HBV特异性CD8+T细胞的数量下降、功能降低，引起免疫耐受。因此，鉴定CTL表位疫苗，增强HBV特异性T细胞免疫反应，打破乙肝免疫耐受，是治疗慢性乙肝的重要手段。本项目首先通过显微注射方法构建含人MHC I类抗原提呈途径中的TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9分子的新型转基因小鼠，预计该小鼠能提高HLA转基因小鼠中HLA提呈表位多肽的效率。针对中国人群HLA分型特点，结合HLA-A11和HBV转基因小鼠，并通过体内多肽洗脱、质谱测序和细胞实验，本研究将利用以上新建立的转基因小鼠进行HBV全基因组CTL表位的筛选和鉴定，以期找到新的更接近于人自然状态下呈递的HLA-A11限制性多肽。

HLA-I类转基因小鼠的应用，使得人们对HLA-I类分子抗原提呈过程及CTL免疫反应有了更为深入的了解，对重要病原表位疫苗的研发具有巨大的应用价值。然而，利用HLA-I类转基因小鼠进行CTL表位筛选时，依然存在着错选或漏选的情形，小鼠自身在抗原加工和转运过程中与人类之间所存在的差异，是造成这种错选或漏选的重要原因之一。因此，为了使HLA-I类转基因小鼠抗原加工与转运系统进一步人源化，本研究构建了一种新型的表达人源抗原加工与转运过程中的重要分子TAP1、TAP2、PSMB8（LMP7）以及PSMB9（LMP2）的转基因小鼠，简称hTAP-LMP转基因小鼠，并通过杂交的方法应用该小鼠对各类HLA-I转基因小鼠进行优化和研究。应用hTAP-LMP小鼠分别与HLA-A2、HLA-A11和HLA-A33转基因小鼠杂交，获得相应的HLA-I/hTAP-LMP多转基因小鼠。我们发现多转基因小鼠中的HLA-I类分子的表达水平均得到了有效提升，提示HLA-I分子在整体水平上对内源性多肽提呈能力的增强。在此基础上，我们还发现HLA-A11分子在多转基因小鼠中提呈乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）CTL表位HBc141-151的能力得到了显著增强，并验证了该表位为HBV核心蛋白中具有免疫优势的HLA-A11限制性CTL表位。. 在上一步工作基础上，我们设计并合成一条包含HBc141-151的长肽疫苗HBc123-157。通过长肽疫苗免疫以及模拟HBV感染的实验，我们发现该长肽疫苗可在HLA-A11/hTAP-LMP多转基因小鼠中诱导强烈的保护性CTL免疫反应，这种增强的CTL免疫反应与HBV在多转基因小鼠体内的迅速清除具有明显的相关性。. 我们的实验表明，hTAP-LMP小鼠作为一种新型的人源化转基因小鼠，对HLA-I类转基因小鼠具有显著的优化作用。优化的HLA-I/hTAP-LMP转基因小鼠平台对我国人群尤其是HLA-A3超家族人群病毒与肿瘤等重大疾病相关治疗性疫苗的研究将具有重要意义。