耻垢分枝杆菌MSMEG_6402基因的敲除及功能研究

聚阿拉伯糖是分枝杆菌细胞壁的重要成分，对该多糖生物合成的研究是了解细胞壁代谢规律的重要环节，在新型抗结核药物研发方面具有重要的作用。目前已知的阿拉伯糖基活性供体是癸异戊烯醇磷酸阿拉伯糖 (Decaprenyl-phospho-arabinose, DPA)，它是阿拉伯糖基转移酶的底物。磷酸酶是DPA生物合成过程中重要的酶，本课题组通过前期工作及采用生物信息学研究方法发现，结核分枝杆菌的Rv3807c及耻垢分枝杆菌的MSMEG_6402是编码磷酸酶的基因。本课题以耻垢分枝杆菌mc2155菌株为实验模式菌，采用基因敲除方法，结合细胞壁多糖结构分析的手段，确定MSMEG_6402是否具有磷酸酶的功能。在此基础上，通过蛋白质组学和代谢组学研究，对MSMEG_6402基因产物在分枝杆菌细胞壁代谢中所扮演的角色进行评价。这些问题的解决，将完善对于DPA合成途径的理解，并为抗结核新药的研发提供依据。

结核分枝杆菌(M. tuberculosis)细胞壁具有独特的结构，其中聚阿拉伯糖是细胞壁的重要组成成分。我们在前期工作中发现聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖（DPA）代谢途径与EMB作用密切相关，并且推测一个未知功能蛋白Rv3807c参与了DPA的合成途径。.为探索Rv3807c的功能以及与DPA代谢途径的相关性，本课题以耻垢分枝杆菌为模式菌，利用基因敲除技术建立Rv3807c的同源蛋白MSMEG_6402的基因敲除菌株（M.sm-ΔM_6402），并通过以下五个方面分析MSMEG_6402功能缺失所引起的生物学特性变化以推测该蛋白的功能。从细菌生长曲线可见，MSMEG_6402功能缺失后，细菌生长缓慢，但未见细菌生长完全抑制现象，所以，该基因为耻垢分枝杆菌生长非必需基因。MTT结果显示， M.sm-ΔM_6402突变菌株对EMB的敏感性增强。MSMEG_6402功能缺失后，菌体形态和细胞壁结构均发生明显变化，菌体表面粗糙且发现细菌死亡碎片；细胞壁结构厚薄不均，扭曲变形，所以，MSMEG_6402功能与耻垢分枝杆菌细胞壁代谢密切相关。MSMEG_6402功能缺失后，细胞壁AG中阿拉伯糖与半乳糖含量比值由2.1下降到1.7，所以，MSMEG_6402功能缺失引起阿拉伯糖含量降低，MSMEG_6402的功能与细胞壁阿拉伯糖代谢有关，推测MSMEG_6402可能作为磷酸酶直接参与了DPA合成途径，但仍需特异性磷酸酶活性分析来证明。.由于很难获得纯化的Rv3807c蛋白，我们选择利用MSMEG_6402的纯化产物鉴定磷酸酶活性，以PRPP为底物，证明了MSMEG_6402具有磷酸酶活性。为进一步证明MSMEG_6402与DPA合成途径的关系，以DP和PRPP为特异性底物，利用HPLC-质谱联用技术，在反应产物中检测到低丰度的DP与PRPP的反应产物DPPR。综上所述：MSMEG_6402具有磷酸酶活性，可能催化DPPR生成DPR，从而参与DPA的生物合成过程，但仍需制备特异性底物来进一步直接鉴定其所催化的化学反应。由于MSMEG_6402为Rv3807c的同源蛋白，对其磷酸酶活性的测定可以推测Rv3807c在结核分枝杆菌中的功能。通过本项目研究，初步探索了结核分枝杆菌未知功能蛋白Rv3807c的功能，完善了DPA合成代谢，为抗结核药物靶点开发奠定基础。