泛素活化酶1在斑马鱼肝脏发育中的功能研究

肝脏是脊椎动物的重要器官，其发育的分子机理研究尚待深入研究。正向遗传突变筛选是系统研究肝脏发育的有效手段。斑马鱼中器官发育的分子机理与哺乳动物相似，且适合于正向遗传突变筛选，在已开展的正向遗传筛选中，我们发现 m264号突变体的胚胎肝脏发育缺失或不全，定位克隆的结果显示泛素活化酶1中编码第247位酪氨酸的TAT突变成一个早熟终止密码子TAA。泛素化通路是调节蛋白质代谢的重要途径，泛素活化酶1催化此通路中的第一步反应，它在肝脏发育过程中的功能未见报道，本课题拟通过以下研究来揭示其分子机理：1，运用遗传学方法证明定位克隆的正确性；2，检测致变基因的时空表达模式； 3，运用细胞移植技术研究致变基因的自主性；4，检测突变体胚胎在肝脏发育各个时期的表型；5，研究基因突变对肝脏发育中已知重要因子和未知蛋白稳定性的影响；6，运用深度测序技术比较突变体与野生型基因表达谱的差异，寻找基因突变的下游基因。

蛋白泛素化参与调控包括细胞增殖、分化和死亡等在内的众多重要的生理过程，泛素活化酶1催化蛋白泛素化E1-E2-E3级联反应的第一步，真核生物中通常只有一个或者几个E1，其在胚胎发育中的功能报道甚少。在斑马鱼消化器官发育突变体的筛选中，我们获得了突变体m264，突变体中消化器官的早期发育未受影响，在60hpf以后的增殖生长中，消化器官发育缺失。遗传分析表明泛素活化酶1是突变基因，突变使得第247位Tyr成早熟终止密码子，此突变导致了泛素活化酶1的功能缺失，突变体的蛋白泛素化水平降低，而P53等依赖于泛素化后降解的蛋白累积于消化器官内，并导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。在突变体中敲降P53可挽救其消化器官发育缺陷的表型，并挽救细胞周期阻滞和细胞凋亡，这暗示上调的P53是突变体表型的原因。泛素活化酶1在2-4天的胚胎中富集于消化器官表达，与上调的P53位置相同，这表明突变体表型的分子机制是突变体消化器官内的泛素活化酶1功能缺失上调P53，使得消化器官细胞周期阻滞和细胞凋亡，导致消化器官发育缺陷。