三疣梭子蟹耐盐性状分化的分子机理研究

The swimming crab, Portunus trituberculatus, is an important marine fishery and aquaculture species. Salinity tolerance traits were significantly different between different families and individuals in the crab, which greatly influence the survival rate of breeding. In this study, we plan to build genetic linkage map and locate salinity tolerance trait-related QTLs and SNPs by restriction-site associated DNA-sequencing technology (RAD-seq) based on the BC1 pedigree constructed in previous research. Screening the key genes and studing the mechanism of salinity tolerance regulation in the two key periods of salinity tolerance (adaptation period and stable period) according to qPCR, western-blot and RNAi. Analysis of methylation changing pattern between the crab families with different salinity tolerance traits in the period of time before and after salinity stress. The results will elucidate the molecular mechanism of salinity tolerance traits differentiation from the genome, transcriptome and epigenetic level, and promote molecular design breeding process in Portunus trituberculatus.

三疣梭子蟹是我国海水养殖的主导品种之一，在实际生产中发现该养殖品种不同家系或个体间的耐盐性状分化显著，极大影响养殖成活率。本研究基于前期工作基础，拟利用耐盐性状分化显著的BC1全同胞家系材料，借助RAD-seq技术，构建三疣梭子蟹高密度遗传连锁图谱，继而精细定位耐盐相关QTL及SNP标记；结合比较转录组学研究进展，筛选耐盐重要调控通路中关键基因，通过qPCR、western-blot及RNAi技术验证并阐释其在盐度适应两个关键时期（适应期和稳定期）中的作用机制；通过甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，从全基因组水平揭示盐度胁迫前后三疣梭子蟹耐盐性状极化家系间鳃组织中的甲基化变化规律。研究结果将从基因组、转录组及表观遗传学多角度系统阐释三疣梭子蟹耐盐性状分化的分子机理。同时，本研究定位的耐盐性状关键功能基因及SNP座位将推动三疣梭子蟹分子设计育种进程。

三疣梭子蟹是我国海水养殖的主导品种之一，养殖中发现该物种不同家系或个体的耐盐性状分化显著，影响养殖成活率。本研究基于前期工作基础，利用耐盐性状分化显著的家系材料，构建了三疣梭子蟹高密度遗传连锁图谱，共上图10,963个标记，图谱覆盖率为98.85%，平均图谱间距为0.51cM；首次调研了三疣梭子蟹基因组信息，基因组大小为805.92Mb，杂合度为0.96%，重复序列占39.42%，明确了其高复杂基因组特征；结合高密度遗传图谱和转录组数据构建了整合图，并将2,378个功能基因定位于整合图上；率先定位了17个耐低盐性状QTL座位，LOD值2.00-3.06，PVE值9.9-22.4，主要分布于17、39、11和8号连锁群；结合GWAS分析，筛选出与耐盐性状分化相关的SNP标记229个，锚定到24个有注释的基因，KEGG结果显示这些基因主要富集于抗坏血酸和醛糖代谢、戊糖、葡萄糖醛酸转换、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解以及错配修复等pathway中，表明这些进程可能与三疣梭子蟹耐盐性状分化相关；利用整合图信息，同时结合QTL定位及比较转录组学研究结果，发掘蝗抗利尿肽、心激肽、高血糖激素、几丁质酶及甲基转移酶等6个与耐盐性状相关的基因，完成了基因克隆及序列分析，并利用qPCR和RNAi等技术验证了其在三疣梭子蟹盐度适应中具有重要作用；利用先进的MethylRAD技术，在耐低盐性状分化家系中进行DNA甲基化检测，筛选出盐度胁迫前后CCGG模式差异表达的甲基化位点7,575个，CCWGG模式差异表达的甲基化位点923个，其中最主要的类型为盐度胁迫后先下调之后上调的表达模式，占总差异位点的67%。筛选到低盐敏感（S）和低盐耐受家系（T）间差异的甲基化位点16,978个，并对有注释信息的甲基化位点进行KEGG富集分析。结果表明DNA甲基化在三疣梭子蟹盐度适应中具有重要功能，其中代谢(Metabolism)、疾病(Diseases)、环境信息处理(Environmental Information Processing)等pathway的甲基化差异可能是导致耐盐性状分化的原因之一。本项目完了所有考核指标，从基因组、转录组及表观遗传学角度解析了三疣梭子蟹耐盐性状分化的分子机理。同时，本研究定位的耐盐性状相关功能基因及SNP标记有助于推动三疣梭子蟹分子设计育种进程。