基于血脑屏障跨膜蛋白基因表达与调控的芳香开窍药"开窍"机制研究

芳香开窍药具有开窍醒神功效,在中医治疗急重症中应用广泛，给予开窍药后能使昏迷患者神志苏醒，能够进入或促进药物进入脑内治闭窍神昏证。而古医籍没有阐明何为 "心窍"及其生理部位。本课题组通过前期实验和相关资料得出初步结论，所谓 "心窍"在解剖学上主要对应 "血脑屏障"。本项目拟应用4种常用开窍药作为靶药,以转基因斑马鱼为模型，通过BBB荧光转染、电镜观察、整体原位杂交、免疫组化等方法研究BBB相关基因和蛋白如ZO、occludin、claudins、Tricellulin、JAMs等的调控及BBB超微结构的生理病理变化，寻找各开窍药对BBB的作用靶点。并运用微透析法观察不同剂量开窍药的有效成分对给药前后大鼠脑中神经递质含量与药物浓度变化。结合分子药理学手段来研究开窍药"开窍"作用机理，解释开窍药作为"引药"的临床价值，也为临床合理配伍开窍药，提高药物在组织器官中的浓度，有效治疗疾病提供依据。

本课题首先通过微透析技术和渗漏实验证实了开窍药可促进物质（地西泮，大分子荧光物质，美罗培南，舒必利)入脑，具有开窍的功效。探究其开窍机理表现在两个方面，通过影响与BBB有关的重要蛋白Claudins表达，主要使其下调，以及BBB超微结构的改变，表现在基膜出现断裂，膨大的现象，紧密连接结构疏松，内皮细胞出现皱缩，这些引起BBB结构疏松，使BBB通透性增强。但这些影响在一段时间之后都会恢复，该过程是可逆的，不会引起病理性损害。另一方面，开窍药引起正常大鼠和脑缺血模型大鼠纹状体内神经递质含量变化，冰片和麝香使正常大鼠纹状体内四种神经递质（Gly、γ-GABA、Asp、Glu）显著增加。石菖蒲增加了γ-GABA的表达，减少了Glu的含量。苏合香增加了ASP的含量，减少了Gly的表达，这可能是开窍药芳香开窍机理之一。而在脑缺血模型中，应用开窍药后，Asp、Glu 降低，Gly、γ-GABA升高。说明开窍药可以透过BBB，并可降低脑缺血时的兴奋性神经递质Asp、Glu，减少兴奋性氨基酸的毒性，从而保护脑缺血后继发神经元的损伤，改善脑缺血。冰片，麝香酮，α-细辛醚的斑马鱼胚胎安全性评价发现长期大剂量使用开窍药对斑马鱼胚胎发育具有明显的影响。因此建议婴幼儿，孕妇，哺乳期妇女慎用开窍药。.这些发现探索了开窍药的“开窍”机理，通过影响BBB紧密连接蛋白的表达，影响超微结构的改变，以及引起脑内神经递质含量变化，来促使自身以及其它物质入脑，解释了开窍药作为“引药”的临床价值，也为临床合理配伍开窍药，提高药物在组织器官中的浓度，有效治疗疾病提供了依据。