桦褐孔菌纯化多糖ET组分降血糖构效关系及其菌丝体发酵代谢调控机理研究

Phaeoporus obliquus contains dozens of active components. The former research project found that the crude polysaccharide isolated from phaeoporus obliquus has the remarkable hyppglycemic effect and obtained the purifiied polysaccharide ET which has higher hypoglycemic activity after further isolation and purification.In this subject, the hypoglycemic effect mechanism of the purifiied polysaccharide ET will be researched though the in vitro experiment and animal experiment , and the relationship between structure and function of hypoglycemic polysaccharide will be obtained through the comparison in structure of the other polysaccharides from phaeoporus obliquus with the purified polysaccharides ET component.This project will provide evidence for the design and development of new hypoglycemic safety material. The objective of this project is to use fermentation engineering technology to produce Phaeoporus obliquus mycelium reveal the mechanism of synthesis of bioactive polysaccharide ET ;and obtain the metabolic mechanism of active mycelium polysaccharide component ET, provide the theory basis for the high activity of polysaccharide ET components, rather than total mycelium yield and total polysaccharide content.

项目前期研究发现桦褐孔菌中的粗多糖具有较强的降血糖活性，对桦褐孔菌多糖进一步分离纯化和动物体内实验，获得了具有较高降血糖活性的分离纯化多糖ET组分。本项目通过体外实验和动物体内实验研究该物质降血糖的机理，对比桦褐孔菌中其它多糖与该纯化多糖ET组分的结构和活性差异，获得该多糖的构效关系；运用发酵工程技术生产桦褐孔菌菌丝体，分析活性多糖ET产量与桦树中特殊成分合成的关系，并根据外源调控物质添加推测该物质的代谢途径及生成的启动因子；研究菌丝体发酵过程条件与纯化多糖ET组分含量、结构和活性的关系，揭示调控菌丝体发酵条件提高目标活性物质产量的机理。项目的研究为新型降血糖安全物质的设计开发提供依据，为糖生物学研究提供理论参考，为采用发酵方法控制天然产物活性物质的结构和活性提供依据。

本项目对桦褐孔菌子实体多糖分离纯化，获得具有较高降血糖活性的纯化多糖ET组分及其他5种纯化多糖。通过动物体内实验得出ET组分降血糖机理为显著影响链脲佐菌素（STZ）诱导的高血糖小鼠血清甘油三酯水平、提高血清中胰岛素水平、改善脾细胞功能和促进肝组织恢复；体外实验发现ET组分通过抑制α-葡萄糖苷酶活性和促进细胞葡萄糖消耗起到降血糖作用。.分析对比桦褐孔菌子实体中其他多糖与纯化多糖ET组分的结构和活性差异，明确其构效关系。研究发现ET组分中结合蛋白的活性中心可能含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸、赖氨酸或精氨酸，且β-1,4-葡萄糖苷键、α-1,2-鼠李糖苷键或α-1,6-鼠李糖苷键可能位于其活性中心关键位置；结构修饰（硫酸化修饰）能够提高α-葡萄糖苷酶抑制率并促进HepG2细胞葡萄糖消耗，从而提高其生物活性。.分离纯化桦褐孔菌菌丝体胞外多糖，其ET组分也是通过抑制α-葡萄糖苷酶活性和促进细胞葡萄糖消耗起到降血糖作用，且通过测定基础糖刺激（BIS）和高糖刺激（GSIS）培养下大鼠INS-1胰岛细胞的胰岛素分泌量，发现其能够少量刺激胰岛细胞分泌胰岛素，而另外分离纯化菌丝体多糖EIOP可显著刺激胰岛细胞分泌胰岛素。分析其单糖组成、糖苷键的构型等结构与功效的关系，并与子实体ET组分的结构差异进行对比。.运用发酵工程技术生产桦褐孔菌菌丝体，研究发现桦树中不同营养成分（桦树浸提汁、VB1、VB6及白桦醇）可显著提高多糖产量，增强其α-葡萄糖苷酶抑制活性并影响其单糖种类及组成。对是否添加VB6条件下液体发酵桦褐孔菌菌丝体的基因表达谱及代谢差异进行分析，功能检索得到17个关键差异基因，这些基因与α-淀粉酶活性、糖苷水解酶、糖酵解/糖异生等相关，主要参与碳水化合物的代谢，并通过影响单糖代谢、糖酵解、葡萄糖转化等影响多糖的合成，揭示了调控菌丝体发酵条件提高目标活性物质产量的机理。.该项目可为糖生物学研究提供理论参考，并为采用发酵方法调控天然产物活性物质的结构和活性提供依据，以期推动新型降血糖安全产品的开发生产。