三疣梭子蟹耐低盐性状相关基因的筛选及SNP关联分析

The effect of salinity on the survival, growth and immunologic defence of crustacean is enormous. Then molecular mechanism of adaptability of crustacean to salinity is emphasized. But the study of Portunus trituberculatus is behind. In response to this phenomenon, some questions will be studied in the project. Fist, families of low-salinity resistant improved strains were established, and families of low-salinity sensitive were established by wild population. RNA-Seq whole-transcriptome analysis of pooled cDNA samples fom low-salinity sensitive and resistant families, respectively. Then, we will establish the potentionally regulatory pathway and its network sequence by analysing transcriptomics and.bioinformatics of the transcriptom. Some genes associated with effects of salinity change will be selected. Variation of gene will be analysed in different families of low salinity stress by RT-PCR. SNPs of candidate genes will be find.SNP markers associated with low-salinity resistant will be identified. Then molecular inheritance mechanism of the suitability of salinity will be opened out. The study will provide theoretical evidence for breeding and spreading, at he same time provide a new technique for molecular marker for the genetic breeding of Portunus trituberculatus.

自2010年起，本课题组连续经过4代家系选育，获得三疣梭子蟹耐低盐品系1个，该品系耐低盐能力得到显著提高。但尚不了解该品系耐低盐的分子机理，同时缺乏一种可以辅助三疣梭子蟹耐低盐品种培育的分子标记。针对这种现象，本项目首先以三疣梭子蟹耐低盐品系家系为材料，以野生群体低盐敏感家系为对照，利用新一代高通量测序方法（HiSeq2000）进行转录组测序，通过转录组学和生物信息学分析，构建三疣梭子蟹耐低盐性状相关基因调控网络，从中筛选与耐低盐性状相关的关键基因，利用实时定量PCR技术，分析候选基因在耐低盐家系和敏感家系中的表达差异；发掘候选基因中SNP位点，解析SNP基因型特征，通过关联分析，获得与耐低盐性状相关的SNP标记，并进行生产性验证。结果不但为揭示三疣梭子蟹耐低盐品系盐度适应性的分子机理提供数据，而且为耐低盐品种的培育提供一种分子标记。

盐度作为一种与渗透压密切相关的环境因子，对甲壳动物的呼吸代谢、生长、存活及免疫防御有着极其重要的影响，多雨季节低盐胁迫易引起池塘养殖梭子蟹大量死亡，是影响产业健康发展的一个技术难点，因此三疣梭子蟹耐低盐新品种选育及其盐度适应的分子机制解析是一个广受关注的生物学问题。本课题以三疣梭子蟹低盐耐受型、敏感型家系为材料，提取低盐海水(盐度11，72h半致死浓度)胁迫0h、6h、12h、48h、72h耐受型、敏感型家系鳃组织样品，然后进行转录组测序，发掘差异表达基因9,475条，涉及离子转运蛋白基因、离子通道蛋白基因、神经肽基因和氨基酸代谢相关基因等，离子转运基因显著差异表达，包括Na+/K+-ATPase、V-ATPase、碳酸酐酶、几丁质酶和钙网蛋白等；GO富集结果显示，差异基因主要富集于生物调节、细胞过程、代谢过程、单有机体过程、细胞组分、细胞膜等GO条目；KEGG信号通路富集结果显示，差异基因主要富集于代谢通路、吞噬小体通路、癌通路和核糖体蛋白通路。根据基因差异表达分析、GO富集分析、KEGG富集分析等生物信息学数据，参考NCBI数据库中其他近缘物种与盐度适应性相关基因，选择转录组中，与盐度适应性相关的蝗抗利尿肽（PtNP）、甲基转移酶(PtDNMT1)、高血糖素（PtCHH）、心激肽（PtCCAP）、几丁质酶（PtCht3）、高迁移率族蛋白（PtHMGBa）等6个关键基因，根据转录组测序得到的关键基因片段序列，获得关键基因cDNA全长与组织表达分布规律；利用盐度胁迫实验材料，采用实时定量PCR技术分析关键基因表达变化规律，验证关键基因与三疣梭子蟹盐度适应性的关联性；结果证实6个关键基因在三疣梭子蟹渗透压调节过程中发挥重要作用。根据p-value值，将转录组中与盐度适应显著相关基因作为候选基因（P<0.01），自候选基因中查找SNP位点60个；利用混合DNA样品进行PCR扩增、测序验证，获得可进一步分析的SNP位点46个；在敏感型、耐受型个体间进行验证，采用单因素方差分析，最终验证出与低盐耐受性显著相关的SNP标记5个。研究结果将有效指导三疣梭子蟹耐低盐新品种选育。