ERK1/2-Drp1分子通路在高血糖加重脑缺血损伤中的作用

Diabetes induced hyperglycemia aggravates ischemic brain damage and its molecular mechanisms are poorly understood. Results obtained from our pilot study demonstrate that diabetic ischemia drastically activates ERK1/2 signaling pathway in the brain structures that are specifically damaged in diabetic animals. The present proposal aims to test our hypothesis that ERK1/2 active Drp1,which subsequently inducing mitochondrial fission and autophagy and causing proapoptotic Bax translocation to the mitochondria to facilitate the formation of mitochondrial permeability transition pore (MPTP). The role of ERK1/2 - Drp1 pathway will be examined in rat models of diabetes and cerebral stroke, in combination with ERK1/2 specific inhibitor PD98059. Mitochondrial fission and autophagy will be analyzed using q-PCR, protein blotting, immunohistology, computer-assisted mitochondrial image analysis, and electron microscope. The MPTP formation will be determined by the measurements of mitochondrial membrane potential and mitochondrial calcium loading capacity. The present study will further definite the molecular mechanisms of diabetes enhanced ischemic brain damage and identify moved therapeutic target.

糖尿病引发的高血糖加重脑缺血组织损伤，机制不明，且缺乏有效治疗措施。本课题前期研究发现糖尿病脑缺血显著激活ERK1/2分子信号并且ERK1/2表达在糖尿病导致的脑缺血损伤区域。本课题检验以下假说：即糖尿病通过激活ERK1/2使得Drp1磷酸化。P-Drp1一方面造成线粒体分裂和自噬；另一方面促使促凋亡因子Bax移位于线粒体导致线粒体膜通透孔（MPTP）开放，进而使细胞死亡通路激活，DNA断裂，细胞死亡。本课题应用糖尿病脑缺血动物模型结合特异性ERK抑制剂阐明ERK1/2-Drp1通路在介导糖尿病脑缺血损伤中所起的作用；应用定量PCR、蛋白印迹、组织学和组化荧光染色、计算机程序辅助的线粒体图像分析、电镜超微结构观察等技术深入研究线粒体分裂和线粒体自噬在糖尿病加重脑缺血损伤中的作用。研究结果有助于进一步揭示糖尿病加重脑缺血损伤的分子机制并确认新的治疗靶标。

本课题为阐明ERK1/2-Drp1通路在介导糖尿病脑缺血损伤中的作用，揭示糖尿病加重脑缺血损伤的分子机制并确认新的治疗靶标。采用大鼠糖尿病脑缺血再灌注损伤模型，结合ERK1/2抑制剂PD98059的抑制作用，通过大鼠行为能力学，分子生物学、病理组化学、线粒体膜电位等生物学技术进行比较观察。研究结果：（1）糖尿病脑缺血再灌注损伤动物制模，其术后行为学评分显著增高，ERK1/2抑制剂PD98059给药组，行为学评分与对照组比较有显著降低。ERK1/2抑制剂PD98059对于糖尿病脑缺血再灌注损伤动物行为能力有改善。（2）与假手术组比较，缺血再灌注组（I/R）与I/R使用PD98059组均呈现线粒体膜电位JC-1比值显著性下降，但在1、3及7天处理时间中，随处理时间延长逐渐上升恢复，尤其I/R+PD98059组JC-1比值升高恢复速度更快。糖尿病脑缺血联合使用PD98059后则脑组织细胞凋亡数量远低于单纯糖尿病脑缺血处理，而且细胞凋亡数量随时间下降速度快于单纯糖尿病脑缺血处理。说明缺血再灌注确实对大鼠脑部组织线粒体活性产生影响，而抑制ERK1/2有改善脑组织线粒体活性的作用，减少细胞凋亡，改善预后。（3）糖尿病大脑缺血再灌注后，大脑组织中RAS、ERK1/2、 p ERK1/2、Drp-1及pDrp-1的表达显著激活。使用PD98059后，糖尿病大鼠脑部组织中ERK1/2激活不同时间点均显著性被抑制，而同时Drp-1及Fis1激活亦受到显著性抑制，Mfn1/2及OPA-1的激活却显著性升高。PD98059处理后，在不同处理时间点均可导致Beclin-1及LC3II表达下降，抑制细胞自噬作用。本课题得出结论抑制ERK1/2，抑制下游Drp-1的表达，从而改善脑组织细胞线粒体分裂，抑制细胞自噬，减少脑组织细胞死亡。抑制ERK1/2可能成为糖尿病脑缺血损伤的新治疗靶点。