基于Fas-FasL膜微区形成并激活死亡诱导信号复合物的时空动态研究

Formation and activation of death inducing signaling complex(DISC) are important for Fas-mediated apoptosis and clinical therapy,but the dynamics of interaction network are not clear.The applicant observed high resolution images of Fas-FasL membrane microdoamins organization in previous study.The membrane microdomains exist stably and the sizes of distribution areas affect the speed of apoptosis.We speculate that the intracellular signaling molecules may be gatherd to the area of membrane microdomains to form DISC clusters composited of Fas/FasL and thus switch apoptotic signal.To study the dynamic mechnisms of such processes,we will use artifical membrane FasL to stimulate living cells for apoptosis inducing.The target molecules such as FADD and procaspase 8 will be fused with fluorescent proteins so that their dynamic properties around membrane microdomains could be observed and studied. This work could provide spatio-temporal informations of FasL-Fas-FADD- procaspase 8-caspase 8 interactive network, reveal the physiological mechanisms of DISC formation and function mediated by Fas-FasL membrane microdomains,and support the drug innovation and clinical therapy based on apoptotic mechanisms.

死亡诱导信号复合物的形成与激活对阐明Fas介导的细胞凋亡有重大意义，对人工诱导生理性细胞凋亡和掌控病理生理反应有重要影响，但复合物分子相互作用网络在活细胞中的动态变化规律及其机制还未得到深入阐释。申请人前期观察到高分辨率Fas-FasL膜蛋白微区的分布图，微区稳定存在且其分布面积大小与细胞凋亡快慢有明显关系。我们推测胞内信号分子会聚集到微区区域形成以Fas/FasL为基础的分子簇群并开启凋亡信号，但该过程的动态机理还不清楚。本项目拟采用人工膜蛋白FasL刺激活细胞来诱导凋亡，利用蛋白质活体荧光标记，观察研究FADD、procaspase 8等靶分子在微区区域的动力学性质，实时考察FasL-Fas-FADD-procaspase 8-caspase 8相互作用网络的时空信息。项目开展不但有利于阐明死亡诱导信号复合物形成并激活的生理机理，还可为以凋亡理论为依据的药物创新和临床治疗提供理论依据。

死亡诱导信号复合物由FasL、Fas、FADD等凋亡信号分子组成，对FasL介导的细胞凋亡起着触发与调节作用，但生理条件下这些分子的动态反应机理尚不明确。项目负责人前期观察到高分辨率Fas-FasL 膜蛋白微区的分布图，微区稳定存在且其分布面积大小与细胞凋亡快慢有明显关系。因此，本项目采用人工膜蛋白FasL 刺激活细胞来诱导凋亡，利用蛋白质活体荧光标记和荧光成像，观察研究FADD等靶分子在微区区域的动力学性质。研究结果首次测到FADD出现在Fas-FasL微区附近且有与Fas-FasL微区共聚的倾向，在微区定位观察的30分钟中内Fas与FADD存在极微弱的荧光共振能量转移，说明FasL介导的细胞凋亡信号传递顺序遵循FasL-Fas-FADD的反应序列，而Fas与FADD相互作用的位置发生在Fas-FasL膜微区的下方。该发现为FasL介导的细胞凋亡理论提供了直接的影像证据。