Par-4在hTERT非端粒酶活性依赖抗凋亡中的作用

Telomerase and age-related endocrine-metabolic disorders are strongly coupled.As the key protein component of telomerase, hTERT (human telomerase catalytic subunit) anticipate not only the reconstruction of telomerase activity but also the antiapoptosis independent of telomerase activity, however, the machenism is unclear yet. Our previous study proved that Par-4 (Prostate apoptosis reaction factor 4) is a kind of hTERT interaction protein, but it has no effect on telomerase activity. Refering to the relavent reports about the relationship between Par-4 and cell apoptosis. It is indicated that Par-4 may play a part in the hTERT antiapoptosis independent of telomerase activity. The research tries to detect the common subcellular location of Par-4 and hTERT and their interaction site by GST pull-down, to enhance and silence the expression of Par-4, and evaluate its effect on hTERT antiapoptosis independent of telomerase activity, and to construct the Par-4 binding site deletant of hTERT (hTERTΔ) and the hTERT binding site deletant of Par-4 (Par-4Δ), and evaluate the effect of hTERTΔ on cell spoptosis and the effect of hTERT on Par-4Δ' inducing apoptosis. The purpose of his research is to clarify the function and the status of Par-4 in the hTERT antiapoptosis independent of telomerase activity.

端粒酶与衰老和增龄性内分泌代谢疾病密切相关，hTERT是端粒酶关键蛋白组分，除参与重构端粒酶活性外，还具有非端粒酶活性依赖的抗凋亡作用，具体机制迄今未明。我们前期的研究发现Par-4是一种hTERT相互作用蛋白，但对端粒酶活性无影响。结合Par-4与细胞凋亡有关的报道，提示其功能可能在于hTERT非端粒酶活性依赖的抗凋亡环节。本项目拟采用细胞共定位方法检测Par-4与hTERT共同的亚细胞水平定位；利用GST pull-down明确它们的相互作用位点；增强和沉默Par-4表达，观测其对hTERT非端粒酶活性依赖抗凋亡作用的影响；同时构建hTERT的Par-4结合位点缺失体hTERTΔ和Par-4的hTERT结合位点缺失体Par-4Δ，检测hTERTΔ对细胞凋亡及hTERT对Par-4Δ诱导凋亡的影响，以期明确Par-4在hTERT非端粒酶活性依赖抗凋亡中的作用和地位，为应用研究提供线索。

我们在动物和细胞模型中通过western blot，免疫荧光染色，免疫共沉淀，TUNEL，ELISA，凝胶迁移电泳技术等方法，证明了Par-4抑制h-TERT参与2型糖尿病β细胞凋亡中的作用和地位，并构建Par-4和h-TERT缺失突变体，通过生物膜分子干涉技术明确了两者直接结合关系及具体部位。.本项目采用2型糖尿病小鼠模型和高糖高脂干预的NIT-1细胞模型，采用过表达和阻断par-4研究2型糖尿病胰岛β细胞凋亡的影响。我们的研究发现：正常培养的胰岛β细胞在下调Par-4表达后不会影响凋亡，两组细胞TERT表达基本一致；在高糖高脂诱导的内质网应激存在前提下，Par-4表达水平才会影响NIT-1细胞的凋亡，与TERT表达呈负相关，与内质网应激程度呈正相关，该实验证实Par-4有可能通过抑制TERT表达和内质网应激参与2型糖尿病胰岛β细胞凋亡过程；进一步发现，高糖高脂诱导的内质网应激可促进Par-4分泌，降低增加胰岛β细胞核内Par-4的表达，Par-4抑制Akt磷酸化从而抑制PI3K-Akt信号途径，增高内质网应激，促进胰岛β细胞凋亡，抑制Par-4表达可减弱这一过程，说明Par-4/TERT-内质网应激可能是解释胰岛β细胞凋亡的一条新通路；.同时，我们构建了2型糖尿病Par-4基因敲除小鼠，在动物实验中进行了上述结果的证实。并在体外试验中进一步通过构建缺失突变体并通过分子生物膜干涉技术检测其相互作用部位，发现了Par-4（150-293）在体外可以与hTERT（523-924）直接结合。.本研究首次证实了Par-4/hTERT在内质网应激，细胞膜途径和线粒体途径诱导的2型糖尿病胰岛β细胞凋亡中的影响和地位，用免疫共沉淀进一步阐明par-4和h-TERT相互作用在2型糖尿病胰岛β细胞凋亡中的地位及影响，结合调控胰岛β细胞凋亡的具体部位和机制，为2型糖尿病胰岛β细胞凋亡的基因治疗提供新的靶点和方法，也为其他增龄性疾病的治疗提供一定参考。本项目目前共发表SCI论文3篇，中文核心期刊论文4篇，培养博士二名，硕士二名，参与全国大会口头发言两次，壁报交流三次，完成了预先约定的研究内容以及预期成果，获得了一定的社会和经济效益。