运动预处理通过mitoKATP所介导的信号通路诱发脑缺血耐受的机制研究

Exercise preconditioning before ischemic stroke could increase the brain tolerance for the subsequent serious damage, but the specific mechanism was still not clear. According to our previous study, the exercise could reduce the brain damage after ischemic stroke through the glutamate system.Based on the related literature and our previous study, we speculated that exercise preconditioning could activate mitoKATP and affect its downstream protein (inhibiting PKC phosphorylation and activating PI3K) so as to reduce the glutamate neurotoxicity. In this study, we plan to use a series of techniques to observe the influence of exercise preconditioning on the key proteins of the signal pathway, including Western blot、Real-time PCR、Tissue staining, Microdialysis and HPLC techniques. Moreover, the inhibitors of key proteins also will be used to verify the importance of these key proteins. Furthermore, the cell model of oxygen and glucose deprivation will be used to verify the influence of the key proteins and theirs inhibitors on the glutamate transporter so as to clarify the mechanism of brain ischemia tolerance induced by exercise preconditioning through the signal pathway regulated by mitoKATP.

缺血性脑卒中发生之前进行运动训练能够使得脑组织对后续发生的严重损伤具有较强的耐受能力，但其具体机制有待进一步阐明。课题组前期研究发现，缺血前运动训练可通过作用于谷氨酸系统而减轻脑缺血发生后的脑损伤。结合文献及既往工作基础，我们推测：运动预处理通过作用于mitoKATP所介导的信号通路而减轻谷氨酸神经毒性作用。本项目拟在脑缺血再灌注大鼠模型上，采用Western blot、Real-time PCR、组织染色技术、微透析以及高效液相技术等方法观察缺血前运动训练对mitoKAT所介导的信号通路各关键蛋白的影响，并应用各关键蛋白的抑制剂从反面验证。此外，通过细胞氧糖剥夺模型来进一步探索信号通路各关键蛋白及其抑制剂对谷氨酸转运体摄取谷氨酸的能力的影响，进而阐明mitoKATP所介导的信号通路在缺血前运动训练通过谷氨酸系统发挥神经保护作用的机制，为运动训练作为缺血性脑卒的防治措施提供坚实的理论基础。

既往研究表明，缺血性脑卒中发生之前进行运动训练能够使得脑组织对后续发生的严重损伤具有较强的耐受能力，但其具体机制有待进一步阐明。本研究将120只SD雄性大鼠分为三组：假手术组,缺血组，缺血前运动训练组。 运动训练组大鼠经过三周跑台训练后与其他大鼠接受大脑中动脉梗塞/再灌注的手术或假手术。术后24小时，每组6只大鼠用于神经行为学评定后检测脑梗死体积，每组6只大鼠用于检测SOD的浓度，每组6只大鼠用于检测MDA的浓度，每组6只大鼠用于检测PI3K、total-ERK1/2及phospho-ERK1/2的蛋白表达水平. 每组6只大鼠在缺血280分钟后用于NR2B及mGluR5的real-time PCR检测分析，每组10只大鼠用于免疫组化分析。研究结果为：缺血前运动训练组的神经功能缺损评分低于缺血组（p<0.05）；缺血前运动训练组的脑梗死体积小于缺血组（p<0.05）；关于SOD的浓度，缺血前运动训练组高于缺血组，缺血组高于假手术组大鼠（p<0.05）；关于MDA的水平，缺血组大鼠高于缺血前运动训练组，缺血前运动训练组高于假手术组（p<0.05）；缺血组的NR2B及mGluR5的mRNA相对表达水平高于假手术组，假手术组高于缺血前运动训练组(p < 0.05)；缺血组的PI3K的蛋白表达水平高于假手术组，缺血前运动训练组高于缺血组(p < 0.05)；三组之间的Total-ERK1/2的蛋白表达水平的差异不具有统计学意义(p > 0.05)；缺血组的Phospho-ERK1/2的蛋白表达水平高于缺血前运动训练组，缺血前运动训练组高于假手术组(p < 0.05)。研究结果表明，运动训练加缺血组大鼠的脑梗死体积及神经行为学评分均低于缺血组大鼠，表明缺血前的运动训练减轻了大脑中动脉梗塞/再灌注所造成的神经损伤；缺血前运动训练通过增加SOD的水平而增强了大鼠脑组织的抗氧化能力，通过降低MDA的水平有效减低了脑缺血发生后膜脂质过氧化的程度；缺血前的运动训练通过抑制mGluR5和NR2B的mRNA表达水平，并提高GLT-1的表达水平，从而有效降低了脑缺血再灌注后谷氨酸的毒性作用；缺血前的运动训练通过提高HSP60的表达水平减少脑组织损伤，提高NRF-1表达水平从而诱导各种细胞保护性蛋白的表达。总而言之，缺血前运动训练能够提高机体对后续发生严重神经损伤的耐受能力，从而发挥神经保护作用