内源性脂质亲电子化合物通过抑制Keap1 and GSK3β激活Nrf2途径：脑缺血预处理的新机制

Ischemic stroke is the leading cause of long-term disability and a leading cause of death. Though the FDA has approved tPA for restoring blood flow, no medicine is available for the purpose of neuroprotection. Ischemic preconditioning (IPC) has recently been proven to be a promising approach for protecting against ischemic injury; however, the underlying protective mechanisms are not clear. Using both in vitro and in vivo methods, we have obtained interesting preliminary results suggesting that IPC protects the brain against ischemic injury, and that the neuroprotection depends on the transcription factor Nrf2 and on endogenous generation of lipid electrophiles via mild oxidative stress. Suppressing Nrf2 or neutralizing electrophiles with N-acetylcysteine eliminates the ischemic tolerance. Electrophiles robustly activate Nrf2, induce phase 2 enzymes and protect mouse brains or cultured rat neurons from ischemic injury. Furthermore, electrophiles inhibit GSK3β activity in neurons, which may contribute to Nrf2 activation. The purpose of this proposal is to further investigate the mechanisms responsible for Nrf2 activation and neuroprotection induced by IPC. The overall hypothesis of this proposal is that IPC causes mild oxidative stress in the brain, leading to the generation of a sublethal amount of lipid electrophiles; these electrophiles then activate the Nrf2 pathway via suppressing both Keap1 and GSK3β. Two specific aims are proposed: Aim 1 tests the hypothesis that IPC offers long-term neuroprotection against focal ischemia in mice; Aim 2 tests the hypothesis that lipid electrophiles activate Nrf2 via inhibiting Keap1 and GSK3β in both neurons and astrocytes. The investigation of the protective mechanism of IPC will help in developing neuroprotective strategies against stroke via endogenous regulatory mechanisms.

缺血性脑卒中是造成我国人口死亡和致残的最主要疾病。除再建脑血流外，目前尚无有效神经保护措施。缺血预处理(IPC)对脑缺血具有确切保护作用，但机制尚不明确。我们在前期研究和预实验中发现，IPC能减轻脑梗塞体积，其保护作用和激活转录因子Nrf2和上调血红素氧合酶-1等有关；中和内源性脂质亲电子化合物或抑制Nrf2活性能明显降低IPC对脑缺血的保护作用。因此我们推测，IPC对脑缺血的保护作用依赖于轻度过氧化所产生的内源性脂质亲电子化合物，它们抑制Keap1和GSK3β，激活转录因子Nrf2，并上调具有抗氧化功能的2相酶。本项目将在离体和在体模型，通过多种技术手段，验证IPC对脑缺血的长期保护作用；继而阐明IPC后内源性脂质亲电子化合物增加，并通过抑制Keap1和GSK3β而激活Nrf2，从而对脑缺血发挥保护作用。该项目有助于阐明脑的内源性保护机制，有益于制定针对缺血性脑卒中的神经保护和治疗措施。

脑卒中，尤其是脑缺血，是我国人口死亡和致残的主要病因。除用药物或手术方法再建脑血流外,目前尚无有效神经保护措施。缺血预处理(IPC)对动物和人类的脑缺血具有确切保护作用,但机制尚不明确。本课堂的假设是，IPC 对脑缺血的保护作用依赖于轻度过氧化所产生的内源性脂质亲电子化合物，它们抑制Keap1 和GSK3β，激活转录因子Nrf2，并上调具有抗氧化功能的2相酶。我们的动物实验显示，IPC能减轻脑梗塞体积和神经功能损失；其保护作用取决于激活转录因子Nrf2和上调血红素氧合酶-1(HO-1)等有关。如果中和内源性脂质亲电子化合物或抑制Nrf2的活性，能明显降低IPC对脑缺血的保护作用。因此我们推测,IPC对脑缺血的保护作用依赖于轻度过氧化所产生的内源性脂质亲电子化合物,它们抑制 Keap1和GSK3β,激活转录因子Nrf2,并上调具有抗氧化功能的二相酶。本项目利用离体和在体模型,通过多种技术手段,证实IPC可以对小鼠脑缺血产生长期（五周）神经保护作用，包括保护感觉运动功能和学习及记忆功能。而IPC的这种长期保护作用在Nrf2基因敲除小鼠中则基本完全消失。细胞培养结果显示，IPC可以减轻缺氧缺糖所致的神经元死亡和血管内皮细胞死亡，减轻缺氧缺糖引起的内皮细胞通透性变化。IPC的神经保护机制在于引起轻度氧化应急反应，增加内源性脂质亲电子化合物增加,并通过抑制Keap1和GSK3β而激活Nrf2,从而促进具有抗氧化抗凋亡作用的二相酶的表达，对脑缺血发挥保护作用。我们的基因突变结果显示，这些内源性脂质亲电子化合物和Keap1的Cys-288结合，改变Keap1的构想，释放转录因子Nrf2；内源性脂质亲电子化合物也可以和GSK3β中的Cys-199反应，从而抑制它的激酶活性，抑制Nrf2的降解。Nrf2从而可以在神经细胞中积累，发生核转移。我们的凝胶迁移滞后实验(EMSA)结果显示，IPC明显促进Nrf2和DNA的结合活性。更有意义的是，在缺血前给小鼠服用Nrf2激活剂，即使不再给予IPC，同样可以减轻缺血性脑损伤。因此该项目阐明了脑组织的一个重要的内源性保护机制,对制定针对缺血性脑卒中的神经保护和治疗措施具有指导意义。