依赖于微管解聚驱动蛋白CrKin13和胞质微管解聚的纤毛组装分子机制研究

Cilia/flagella are highly conserved and widespread cellular structure, composed of microtubules. As signal antenna of the cell, cilia are controlled for assembly to affect functions of cells and tissues. Therefore, defects in regulation of ciliary assembly are associated with diverse human ciliopathies. However, limited understandings of molecular mechanisms underlying ciliary assembly impair our ability to cure ciliopathies. In previous work, CrKin13 is phosphorylated and dephosphorylated during ciliary assembly. Further studies show that residue S100 is the key phosphorylation site for its microtubule depolymerizing activity regulation. Cytoplasmic microtubules are depolymerized by CrKin13 to provide tubulin precursors for ciliary assembly. But molecular mechanism of CrKin13 and cytoplasmic microtubules depolymerization dependent ciliary assembly are not well understood. This research is focused on CrKin13 and cytoplasmic microtubules to uncover how cytoplasmic microtubules are regulated for free tubulins provide and ciliary assembly, and clarify the cytoplasmic microtubules depolymerizing activity of CrKin13 - dependent ciliary assembly downstream signaling pathway. This study will improve our knowledge of mechanisms underlying ciliary assembly and theoretically support the prevention, diagnose and treatment of human ciliopathies.

纤毛/鞭毛是一种由微管蛋白组成的高度保守，分布广泛的细胞结构。纤毛作为“信号接收器”，其组装的主动性调控将影响着细胞与组织功能的发挥。因此，纤毛组装调控的缺陷常与人类纤毛类疾病相关联。然而，对于纤毛组装分子机制的认识局限，阻碍了对纤毛类疾病的认识与治愈。在前期的工作中，我们发现CrKin13在纤毛组装过程中发生磷酸化与去磷酸化的变化。进一步研究表明该蛋白通过磷酸化S100位点调控其微管解聚活性，并且通过解聚细胞质微管为纤毛组装提供微管蛋白前体。然而依赖于CrKin13及胞质微管解聚的纤毛组装分子机制还不甚清楚。本研究拟从纤毛组装全过程中分析CrKin13与胞质微管解聚的具体关系，揭示胞质微管如何为纤毛组装来提供游离微管蛋白，探明依赖于CrKin13解聚胞质微管的纤毛组装调控下游的信号通路，进一步完善纤毛组装调控理论，该研究将会对纤毛类疾病的预防、诊断与治疗提供理论支持。

纤毛作为真核细胞广泛存在的一种细胞天线结构，起到细胞信号传导与运动，细胞内环境稳态等功能，其结构与功能的缺陷常导致细胞生理功能的异常，进一步导致人类纤毛相关疾病。然而对于纤毛组装调控机理的认识局限，限制了人们对于纤毛疾病发病机制的了解。本课题从微管解聚马达蛋白CrKin13与微管蛋白入手，研究了纤毛组装三阶段中CrKin13蛋白与胞质微管解聚是如何介导纤毛组装的分子机制。1）揭示出纤毛组装依赖于CrKin13以及胞质中的微管蛋白质库与微管骨架的解聚；2）纤毛的正常长度以外的再延长阶段是不依赖于CrKin13，仅依赖于胞质微管蛋白质库；3）纤毛脱落刺激组装纤毛的时序为：CrKin13磷酸化→胞质微管解聚→纤毛脱落，并且胞质微管解聚不依赖于纤毛脱落本身。4）细胞在纤毛再生刺激下有更快的微管蛋白周转速率，以用来维持细胞再生纤毛的正常功能。.另外，为了探明纤毛组装调控机制，寻找纤毛组装缺陷突变体，我们通过一系列实验建立了高效稳定方波电转方法。由于筛选DNA用量减少，因此会降低抗性筛选DNA随机插入拷贝数，利于后期DNA突变位点的鉴定；通过对于突变体文库的筛选，我们筛选得到一株编号为I124的藻株，经过RESDA-PCR与DNA序列比对发现其突变基因为Cre03.g181450，并且其在人、小鼠、线虫中的同源蛋白与疾病相关，且定位于纤毛的基部转换区，然而其深入的机制还不甚明了，需要进一步深入研究。 .另外，本研究项目依赖于高效突变体建库的方法，建立了重金属抗性衣藻（Cu2+，Cr6+）的筛选方法，以有利于污水中重金属去除的应用。另一方面在研究当中建立了有效的衣藻去除细菌真菌污染的方法。.根据研究深入开展的科学要求，本人申请出国访学一年，深入学习了哺乳动物细胞中纤毛研究的相关技术，重点集中于哺乳动物细胞纤毛转换区蛋白作为门控装置的动态学变化研究，因此和本人的研究非常相关。为进一步申报课题项目，以及广泛研究纤毛组装机理，尤其是通过转换区蛋白复合体来调控纤毛组装的机理与门控装置的机理有深远意义。