Rab5双重抑制EGFR/mTOR下调胶质母细胞瘤增殖和侵袭的机制

It is an urgent task to develop new molecular therapeutic approaches for glioblastoma via duel inhibition on EGFR/mTOR. In our preliminary study, we found that upregulation of the GTP activity of Rab5 in glioblastoma cell line U87 can inhibit cell proliferation, accelerate the degradation of EGFR and attenuate the phosphorylation of mTOR downstream effector, S6K1. Accordingly, we hypothesize that upregulating Rab5 GTP activity can simultaneously inhibit EGFR/mTOR, which is accomplished by two ways: 1) accelerating early endosome fusion and promoting EGFR transportation to lysosome for degradation; 2)disturbing the subcellular localization and complex formation of mTOR complex, especially mTORC1, and attenuating the phosphorylation of downstream effectors. To test the hypothesis, we will identify the relationship between GTP-Rab5 and EGFR/mTOR in human glioma and normal brain tissues; In U87MG and U87MGΔEGFR cells, by adopting EGFR/mTOR specific inhibitors, immunofluorescence, GST-pulldown and co-immunoprecipitation, we will bidirectionally regulate Rab5 activity and detect its effect on EGFR transportation and degradation, the change of mTOR subcellular distribution and complex formation. The phosphorylation of downstream effectors will also been tested to determine the effect of Rab5 activity on EGFR/mTOR signal transduction. Moreover, we will study the regulation by Rab5 on the cellular proliferation， invasion and tumor growth in the nude mouse model.

研发双重抑制EGFR和mTOR用于胶质母细胞瘤的分子靶向治疗是急待解决的任务。我们发现上调胶质母细胞瘤细胞系U87中Rab5的GTP活性可下调细胞增殖能力、加速EGFR降解并抑制mTOR下游靶蛋白S6K1磷酸化。因此我们推测Rab5双重抑制EGFR/mTOR是通过①加速初级包涵体融合促使EGFR向溶酶体转运降解②改变mTOR复合体（mTORC）形成、胞内分布及靶蛋白磷酸化实现的。本项目拟在明确人胶质瘤组织中GTP-Rab5与EGFR/mTOR关系的基础上，在U87及U87ΔEGFR细胞中双向调控Rab5的GTP活性并结合特异性抑制剂，用免疫荧光、GST pulldown、CoIP等观察其对EGFR转运和mTOR胞内分布及复合体形成的调控，以EGFR/mTOR下游标志性蛋白磷酸化改变观察其信号转导改变，以细胞增殖、侵袭和裸鼠模型研究Rab5双重抑制EGFR/mTOR活性对肿瘤恶性演进的影响。

胶质瘤是最常见的脑肿瘤，约占全部脑肿瘤的 45%。在所有的胶质瘤亚型中，胶质母细胞瘤（WHO IV级）的恶性程度和发病率均高居首位，其具有高度的侵袭性和致死率。虽然采用手术、放疗和化疗等多种综合治疗措施，患者的中位生存期仍然不足一年。开发新的有效的治疗方案是急待解决的问题。 目前胶质母细胞瘤的分子靶向治疗和新药研发主要集中在抑制表皮生长因子受体（EGFR）及其下游靶信号转导通路上，特别是 EGFR 和 mTOR 两个靶点。临床实验结果还显示单独使用EGFR酪氨酸抑制剂或针对mTOR的雷帕霉素及其衍生物治疗胶质母细胞瘤无法取得稳定持久的疗效，具体机制尚不明确。因此设计具备既能抑EGFR 又能抑制 mTOR的双重功能的分子靶向药物已成为治疗胶质母细胞瘤的新理念，并为研究者和临床工作者所期待。我们通过对不同级别人胶质瘤样本行免疫组化检测发现，Rab5在低级别（I+II）胶质瘤表达明显高于高级别（III+IV）胶质瘤，其低表达与患者的不良预后相关。通过在人源胶质母细胞瘤细胞系U87中表达Rab5野生型、显性正性突变体、显性负性突变体或特异性干扰shRNA质粒实现对Rab5表达的双向调控，从而进一步验证其在胶质母细胞瘤细胞中的生物学功能，我们发现Rab5表达水平上调可以双重抑止ERK和S6K1的磷酸化水平，即对MAPK和mTOR信号转导通路均有抑制作用，并抑止胶质母细胞瘤的恶性演进（增殖、侵袭和集落）。在此基础上，我们通过荷瘤鼠模型进一步证实在体环境中，Rab5高表达可以抑制胶质瘤的瘤体体积及增殖速度。上述结果提示Rab5具有双重抑制EGFR/mTOR 的作用，可以成为胶质母细胞瘤靶向治疗的潜在靶点，可能增强靶向治疗的疗效及稳定性。目前受此课题资助共发表SCI论文7篇，其中JCR 1区1篇，IF:5.01，累计影响因子达18.71。