结节硬化复合物1（TSC1）在跟腱细胞转分化与跟腱退变中的作用及其机制研究

Tendon degeneration allows predisposing tendon injury. Direct conversion of tenocytes into chondrocytes plays an important role in tendon degeneration. However, the underlying mechanisms are unkonwn. Our preliminary works demonstrated that deletion of TSC1, the upstream negative regulator of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1), in the tendon cells resulted in constitutive activation of mTORC1 and chondrogenic transdifferentiation and spontaneous tendon degeneration in mice. It is suggested that TSC1/mTORC1 plays an important in the transdifferentiation and degeneration in tendon. This project aims to investigate the role and regulatory mechanism of TSC1/mTORC1 in tendon transdifferentiation from molecule, cell and tissue level by using mice and tendon cells with deletion of TSC1 or Raptor (a specific component of mTORC1). The expression and activation of key transcription factors for chondrogenic and osteogenic differentiation in tendon cells and their regulatory mechanisms will also be explored. This study will provide novel regulatory mechanism for tendon transdifferentiation and the potential therapeutic target for the prevention and treatment of tendon injury and tendonitis.

跟腱退变是跟腱损伤和跟腱断裂的主要诱因，跟腱细胞向软骨细胞转分化在跟腱退变中起重要作用，但其机制尚不明确。我们在前期工作中发现，在跟腱细胞中敲除结节硬化复合物1( TSC1)，使其下游抑制分子雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)在跟腱细胞中活化，小鼠跟腱细胞向软骨与成骨细胞转分化并诱发自发跟腱退变的表型，提示TSC1/mTORC1在跟腱细胞转分化与跟腱退变中起重要作用。本课题拟以跟腱细胞敲除TSC1和Raptor(使mTORC1失活)的小鼠为模型，从分子、细胞及整体水平研究TSC1/mTORC1信号在跟腱细胞转分化和跟腱退变中的作用，探讨TSC1/mTORC1通过调节跟腱细胞中成软骨与成骨分化关键转录因子的表达与活性，从而参与跟腱细胞转分化与跟腱退变的分子机制，为揭示跟腱退变的发病机制提供新观点，为跟腱退变性疾病的防治提供依据和潜在靶点。

跟腱细胞向软骨/成骨细胞转分化在跟腱退变及跟腱异位骨化（HO）的发生发展中具有重要作用，探讨其分子机制和作用靶点对于制定相应临床防治策略具有重大意义。本项目前期研究发现结节硬化复合物1（TSC1）可抑制mTORC1信号通路激活，特异性敲除TSC1可出现跟腱组织的自发性退变以及体外跟腱细胞向软骨细胞分化。此外，课题组发现，内皮-间质转化（EndMT）在跟腱HO病程中扮演重要角色，且EndMT作用的发挥主要与神经营养因子3（NT-3）有关，但HO病程中NT-3的来源以及其调控EndMT的具体分子机制仍待探索。因此，本项目构建肢芽干细胞特异敲除TSC1的转基因小鼠，进一步利用其构建跟腱退变、关节炎等疾病模型，探索TSC1在肢体发育、跟腱退变及关节炎中的作用；探讨mTORC1信号在跟腱HO中的作用，明确TSC1如何调控mTORC1信号通路活化，介导TDSCs向软骨分化的作用及其机制。同时，课题组构建跟腱HO动物模型，阐明NT-3在跟腱HO过程中的来源及作用，明确NT-3通过诱导EndMT加速跟腱HO发病的潜在机制。结果显示：TSC1基因缺失可导致小鼠跟腱及软骨发育异常，证实TSC1在跟腱退变和关节发育的重要作用，也发现TSC1的作用与活化的mTORC1信号通路及其下游效应蛋白密切相关。沉默TSC1可激活mTORC1/NF-kB信号通路，促进NF-kB信号通路下游关键蛋白P65核转位，最终促进TDSCs向软骨细胞分化。与此同时，课题组观察到NT-3在HO病程中的表达，并证实NT-3可以诱导内皮细胞出现EndMT转化，获得间充质细胞干性，进一步分化为软骨/成骨细胞，促进跟腱HO。此外，深入探索NT-3的来源发现，在HO部位可观察到NT-3和巨噬细胞的共定位，提示活化的巨噬细胞可能与NT-3的来源有关。后续体外研究发现炎症环境下的巨噬细胞可促进NT-3蛋白表达，且清除体内巨噬细胞后，血清中NT-3表达水平有所下降。综上，本课题从转基因动物繁育、疾病动物模型构建与评价、细胞体外研究与信号通路分析逐层展开对跟腱退变及跟腱HO中细胞转分化的相关研究，证实TSC1及mTORC1信号通路对跟腱退变及跟腱细胞转分化具有重要作用的同时，亦阐明NT-3作为神经内分泌信号对跟腱HO的调控作用，并从机制研究中进一步探讨该研究的应用前景，为后续制定疾病防治策略的研究提供了基础和保障。