新型双特异性抗EGFR/KDR人源抗体的构建及其抗肿瘤作用的研究

本项目在原核细胞表达重组人表皮生长因子受体胞外区（hEGFR-ECD）蛋白，以其为靶蛋白自噬菌体展示抗体库中筛选抗hEGFR的单链抗体scFV，通过构建抗体可变区突变库，进一步获得原scFv高亲和力的突变体5~10个，再通过同源建模和分子对接，对 scFv分子进行评价；将高亲和力抗EGFR scFv与本实验室高亲和力抗人血管内皮细胞生长因子受体2（KDR）单链抗体AK404进行重组构建双特异性的二价单链抗体（Bi-scDb）5~10个，大肠杆菌表达，随后进行亲和力测定和比较；筛选1个构成高特异性Bi-scDb的一组与IgG恒定区连接，构建真核表达载体，在CHO细胞表达类IgG抗体，建立稳定的真核表达细胞株，测定抗VEGFR/KDR BsAb的与两种抗原的亲和力；最后，对抗体进行稳定性、抗癌细胞增殖和初步的体内抗肿瘤活性研究，同时与两种单特异抗体作比较。

本项目旨在构建靶向表皮生长因子和血管内皮生长因子（EGFR/KDR）的双特异性抗体，实际工作中构建并表达了三种不同分子结构的双特异性抗体，分别为双特异性单链小分子抗体scDb、双特异性双链小分子抗体Diabody和IgG样双特异性抗体Bi-Ab：.一、在原核细胞表达EGFR胞外区蛋白，并以其为靶蛋白筛选出全新的抗EGFR高亲和力单链抗体scFv-E10，进行亲和力鉴定及初步活性研究；.二、将获得的scFv-E10与本实验自主知识产权的抗KDR的高亲和力单链抗体scFv-AK404R进行克隆重组构建串联表达的抗EGFR/ KDR双特异性单链小分子抗体scDb，于大肠杆菌表达并纯化后对其进行相应的鉴定及初步活性研究。.三、将scFv-E10与scFv-AK404R进行克隆重组，构建抗EGFR/ KDR双特异性双链小分子抗体Db，其两条链的片段间连接顺序分别为VLE－G4S－VHK 和 VLK－G4S－VHE，转化大肠杆菌HB2151，表达纯化后对其进行相应的鉴定及体内外抗血管生成及抗肿瘤活性和机制的研究。.四、将scFv-E10与scFv-Ak404R串联后融合至人源IgG1的Fc上，构建抗IgG样双特异性抗体Bi-Ab，转化毕赤酵母X-33，表达纯化后对其进行相应的鉴定及体内外抗血管生成及抗肿瘤活性和机制的研究。.本项目研究筛选的抗EGFR单链抗体E10为全新抗体序列，具有较好的抑制表皮癌细胞A431增殖活性，为抗EGFR单克隆抗体的制备打下基础，具有较高的临床应用价值；构建的双特异性抗EGFR/ KDR抗体，包括双特异性单链抗体scDb、双特异性双链抗体Db及IgG样双特异性抗体Bi-Ab，具有较好的抗肿瘤活性，为抗EGFR或抗VEGFR抗体单独使用疗效不佳的癌症或者增强抗肿瘤效果提供了很好的临床治疗研究思路，也为国内抗肿瘤免疫治疗提供新的治疗方案。.本项目超额完成既定任务，已授权专利1项，公开专利1项；发表基金标注研究论文13篇，其中SCI论文7篇，另有两篇文章分别于2014年11月投稿cancer immununotherapy & immunology和cancer letters，审稿中；培养毕业博士生1名，硕士生1名，另有一名博士将于2015年6月份毕业。