大豆香豆素生物合成途径的酶学催化机制及其调控机理研究

香豆素是一种广泛分布于高等植物中的邻羟基肉桂酸内酯类化合物，在医药、工业、农业上均具有很高的利用价值。然而目前香豆素化合物的生物合成途径并没有被完全理解。本课题的主要研究内容就是通过同源克隆的方法从大豆中克隆香豆素生物合成途径的关键酶基因，利用酵母异源表达系统来鉴定它们的酶学特性和底物特异性；在大豆毛状根中沉默和过量表达相关基因以便研究它们对香豆素生物合成的影响以及对其它次生代谢产物的影响；克隆其它植物的相应基因，比较它们的底物特异性，鉴定发挥酶学特性的关键氨基酸位点，验证酶的反应机制；在酵母中建立不同关键酶的融合基因表达系统，确立利用较低成本的底物生产香豆素类化合物的酵母异源表达系统；利用转基因的方法改变大豆和其它植物的香豆素含量，期望获得符合人们需求的转基因品种。

香豆素是一种广泛分布于高等植物中的邻羟基肉桂酸内酯类化合物，在医药、工业、农业上均具有很高的利用价值。然而目前香豆素化合物的生物合成途径并没有被完全理解。在本研究中，利用同源克隆的方法克隆了大豆、油菜香豆素合成的关键酶GmF6’H1和BraF6’H1，荧光定量PCR分析显示GmF6′H1在大豆根中的表达量最高，其次是荚果、叶和茎；2,4-D处理对大豆GmF6′H1的转录水平影响很小，水杨酸和激动素的处理均显著地提高了该基因的表达，但是随着处理时间的延长，GmF6′H1表达水平稳定下降，最后接近处理前的水平。BraF6’H1也是在根中表达量最高，而且在油菜的根中，BraF6’H1受2,4-D的诱导。酶活特性显示，GmF6’H1和BraF6’H1均能够催化阿魏酰辅酶A生成东莨菪素。采用农杆菌介导法将GmF6’H1基因过量表达转入拟南芥Atf6′h1突变体，转基因拟南芥与Atf6′h1突变体植株外在表型没有明显的差异，而香豆素的含量分析显示，转基因株系根中香豆素的含量相比较拟南芥Atf6′h1突变体有所提高，与野生型拟南芥中香豆素的含量接近。. 考虑到MYB转录因子在植物苯丙酸代谢方面起着重要的调控作用，采用同源克隆的方法，我们获得了1个大豆R2R3-MYB转录因子GmMYB46，该蛋白定位在细胞核中，且具有转录激活活性。实时定量分析显示，GmMYB46在茎和叶中表达量最高；2,4-D，激动素和水杨酸处理均显著地提高了该基因的表达水平。在GmMYB46过量表达的转拟南芥植株中，酚类代谢途径的多个基因被抑制，并且转基因植株中的多酚类物质较野生型明显降低，过量表达GmMYB46也加深了拟南芥木质部的木质化。目前对于食用豆类中香豆素类化合物的结构类型和生物活性尚无深入研究，由于食用豆类是我国重要的农作物，同时香豆素类化合物对于某些疾病的预防和治疗作用，所以本研究对食用豆类香豆素的生物合成与调控具有重要的理论和实践意义。